哈茨木霉SOD基因的克隆及功能研究.pdf

1、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是一種優(yōu)秀的生防真菌,在植物病害,尤其是土壤傳染病害的生物防治中有重要的應(yīng)用價(jià)值。哈茨木霉主要通過重寄生作用、溶菌作用、抗生素作用、蛋白酶作用以及對空間和營養(yǎng)的競爭機(jī)制達(dá)到防治植物病原菌的目的?，F(xiàn)已在生產(chǎn)上已被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治,但由于在各種惡劣的生存條件下哈茨木霉的抑菌功能受到了極大限制和破壞,限制了其優(yōu)秀生防潛力的進(jìn)一步發(fā)揮。因而,有必要提高哈茨木霉的抗逆性,以保證其生

2、防功能順利實(shí)現(xiàn)。本文利用二元表達(dá)載體pBI121,pCAMBIA1301和克隆載體pUC18,成功構(gòu)建了用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化表達(dá)載體pCA-GSOD,可應(yīng)用于各種絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化。該載體含有超氧化物岐化酶(SOD)基因,以潮霉素抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記,目的基因的啟動子為CaMV35S,含T-DNA區(qū)段。pCA-GSOD表達(dá)載體的構(gòu)建,為提高SOD基因在哈茨木霉中的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)哈茨木霉的抗逆性奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用根癌農(nóng)桿

3、菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)從根本上解決了傳統(tǒng)真菌轉(zhuǎn)化方法所面臨的操作繁雜、轉(zhuǎn)化效率低、遺傳不穩(wěn)定等問題。試驗(yàn)中對影響哈茨木霉轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行優(yōu)化,獲得了該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化木霉的最佳條件。經(jīng)過潮霉素抗性選擇培養(yǎng),Southern雜交及傳代分析得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。采用與植物病原菌室內(nèi)拮抗實(shí)驗(yàn),檢測了木霉菌各轉(zhuǎn)化子的抑菌活性。結(jié)果表明通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)所獲得轉(zhuǎn)化子保持了木霉菌的抑菌活性,對三種植物病原菌都表現(xiàn)出良好的拮抗作用。在拮抗機(jī)制上也同木霉

4、菌原菌一樣,主要表現(xiàn)為競爭和重寄生作用。這充分表明,本文的轉(zhuǎn)基因操作沒有影響木霉菌的抑菌能力。對木霉原菌和轉(zhuǎn)化子進(jìn)行高溫和鹽脅迫實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子在逆境下仍能正常存活,且在與植物病原菌拮抗實(shí)驗(yàn)中仍具備較好的拮抗作用;而木霉原菌在逆境下不能正常存活,在與植物病原菌拮抗實(shí)驗(yàn)中喪失其抑菌功能。SOD基因在哈茨木霉中的表達(dá),提高了哈茨木霉對高溫和高鹽的抗逆性,保證了哈茨木霉能夠在高溫和高鹽的條件下發(fā)揮其優(yōu)秀的生防功能。從而,為哈茨木霉的抑菌功