細(xì)胞骨架與胞外滲透壓相互作用的實驗研究.pdf

1、滲透壓作為最重要的環(huán)境影響因子之一，在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。干旱、高鹽等逆境條件都能引起植物生長環(huán)境的滲透壓變化，影響植物的細(xì)胞形態(tài)及生理代謝，導(dǎo)致植物生長發(fā)育改變及生長趨勢改變。但植物細(xì)胞是通過哪些途徑感受環(huán)境滲透壓的變化，調(diào)節(jié)自身形態(tài)及生理生化功能，目前還不太清楚。本論文作為自然科學(xué)基金研究項目《細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體及鈣離子信號在植物細(xì)胞機械力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及相互關(guān)系》的一部分，著重研究環(huán)境滲透壓的變化和植

2、物細(xì)胞微絲、微管骨架動態(tài)變化的關(guān)系，分析植物細(xì)胞內(nèi)微絲、微管在植物感受環(huán)境滲透壓變化中的作用。
　　本課題首先以轉(zhuǎn)基因GFP-FABD2(GreenFluorescentProtein-thesecondactin-bindingdomainofArabidopsisfimbrin)和轉(zhuǎn)基因GFP-MBD(GreenFluorescentProtein–themicrotubulebindingdomainofmicrotubul

3、eassociatedprotein4)及野生col-0型擬南芥種子誘導(dǎo)愈傷組織，然后通過正交實驗優(yōu)化培養(yǎng)液激素水平，建立轉(zhuǎn)基因擬南芥懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系。將懸浮細(xì)胞包埋于低熔點瓊脂中，涂布于底部帶窗口的共聚焦玻皿，通過滴加甘露醇或蒸餾水改變細(xì)胞外環(huán)境滲透壓，利用共聚焦顯微鏡、帶CCD的光學(xué)顯微鏡實時觀測胞外滲透壓改變時細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)及細(xì)胞骨架的變化。最后，借助藥理學(xué)方法干擾細(xì)胞骨架的正常功能，觀察其熒光強度、滲透壓改變時骨架的動態(tài)變化及原生

4、質(zhì)體收縮膨脹情況，并與未經(jīng)藥物處理細(xì)胞對比分析。通過以上研究，本課題共得到以下實驗結(jié)果：
　?、貴ABD2轉(zhuǎn)基因型擬南芥懸浮細(xì)胞最適培養(yǎng)基：MS+100mg/L肌醇+150mg/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.05mg/LNAA+0.05mg/LKT；MBD轉(zhuǎn)基因型擬南芥懸浮細(xì)胞最適培養(yǎng)基：MS+100mg/L肌醇+150mg/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0

5、.5mg/LKT
　　②環(huán)境滲透壓變化對微管骨架的影響：高滲環(huán)境下，原生質(zhì)收縮、微管骨架解聚，解聚后微管蛋白分散于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并伴隨有聚集成斑；低滲環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)膨脹，細(xì)胞內(nèi)的微管束增加
　?、郗h(huán)境滲透壓變化對微絲骨架的影響：高滲環(huán)境下，原生質(zhì)收縮，細(xì)胞中微絲骨架隨原生質(zhì)的縮小而聚攏，同時觀測到原生質(zhì)長軸兩端“郝氏絲”，說明其含有肌動蛋白成分；在微絲收攏的同時，連接于細(xì)胞壁的“郝氏絲”被拉斷解聚；低滲環(huán)境下，原生質(zhì)膨脹，

6、同時細(xì)胞內(nèi)較細(xì)的微絲消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)彌散性綠色熒光，沒有聚集成斑。
　?、芪⒐芄羌軐?xì)胞感受環(huán)境滲透壓變化的影響：細(xì)胞骨架藥物處理，導(dǎo)致細(xì)胞微管平均熒光強度增加。高滲環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)微管骨架平均熒光強度越高，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)收縮程度越強；低滲環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)微管骨架平均熒光強度越高，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)膨脹程度越弱。
　?、菸⒔z骨架對細(xì)胞感受環(huán)境滲透壓變化的影響：細(xì)胞骨架藥物處理，導(dǎo)致細(xì)胞微絲平均熒光強度增加。高滲環(huán)境下，微絲骨架平均熒光強