HIV-1與細胞骨架肌動蛋白相互作用機制的研究.pdf

1、目的：
　?、裥腿祟惷庖呷毕莶《?HIV-1)感染輔助性CD4 T細胞，并引起CD4 T細胞減少及免疫功能下降?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療雖然能夠有效控制疾病的進展，但由于病毒儲存庫的持續(xù)存在，導致藥物不能夠?qū)摲腍IV DNA徹底清除。作為HIV最大的儲存庫靜息CD4 T細胞，已有研究報道不需要細胞的活化，HIV即能夠直接感染靜息CD4 T細胞，并進行整合，進而建立潛伏的病毒儲存庫。然而，HIV感染靜息CD4 T細胞并建立儲存庫的方式仍

2、不明確。新的觀點認為皮質(zhì)肌動蛋白可作為阻止病毒進入靜息細胞及完成細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的屏障，并初步闡明了病毒在宿主皮質(zhì)肌動蛋白層作用方式。
　　肌動蛋白(actin)是生物體中微絲的兩個單體亞基之一，而微絲則是細胞骨架三大組成結(jié)構(gòu)之一。肌動蛋白以兩種形式存在，即單體和多聚體。單體的肌動蛋白是由一條多肽鏈構(gòu)成的球形分子，又稱球狀肌動蛋白(globular actin，G-actin)。肌動蛋白的多聚體形成肌動蛋白絲，稱為纖維狀肌動蛋白(fib

3、ros actin，F(xiàn)-actin)。在電子顯微鏡下，F(xiàn)-actin呈雙股螺旋狀。病毒顆粒進入細胞后，其整合前復合體(preintegration complexes，PIC)必須要轉(zhuǎn)移至細胞核才能進行整合。PIC通過多種蛋白直接結(jié)合到F-actin上。這種結(jié)合對病毒逆轉(zhuǎn)錄及其向細胞核轉(zhuǎn)移過程起著至關(guān)重要的作用。
　　Yoder等人的研究指出，缺少化學信號的刺激或再生性細胞骨架重組，皮質(zhì)肌動蛋白是相對穩(wěn)定的，從而對胞內(nèi)病毒轉(zhuǎn)移起到

4、阻礙作用。為沖破這種局限，HIV利用化學因子輔助受體來激活肌動蛋白的化學活性，從而引起病毒進入細胞及入胞后的早期活動。Yoder等人利用HIV感染靜息CD4 T細胞為模型，證明了HIV介導的來自化學因子輔助受體CXCR4的信號轉(zhuǎn)導對于HIV感染靜息CD4 T細胞是必不可少的。進一步研究證明，gp120激活的化學信號通路可能引起皮質(zhì)肌動蛋白動態(tài)變化，而這種動態(tài)變化正是HIV進入細胞并在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的必要條件。
　　對于HIV-1感染過

5、程需要的兩個CD4輔助受體，CCR5和CXCR4，雖然Yoder對HIV感染靜息T細胞過程中CXCR4的作用進行詳細描述。然而，對于CCR5在HIV感染靜息CD4 T細胞過程中是否發(fā)揮相似的作用，至今缺少針對性的研究。論文一中我們首次證實了HIV介導CCR5信號通路能夠激活cofilin的活化，并參與病毒入胞后的早期階段反應(yīng)，尤其是向核轉(zhuǎn)移的過程，進而在靜息細胞中形成潛在感染。
　　人類CD2分子是普遍存在于所有T細胞、胸腺細胞及

6、NK細胞表面的跨膜糖蛋白，并介導細胞間粘附作用。并有報道顯示，CD2可改變Cofilin的磷酸化狀態(tài);并促進活化的Cofilin向細胞核轉(zhuǎn)移。近期也有研究顯示細胞靜息記憶CD4 T表面高表達CD2分子可以提示病毒儲存庫的存在，但對于CD2信號能否影響HIV感染靜息CD4 T細胞的過程尚不明確。論文二中我們首次證實了CD2信號轉(zhuǎn)導能夠引起細胞內(nèi)肌動蛋白極化狀態(tài)發(fā)生改變，并且抑制HIV對靜息CD4 T細胞的感染過程。
　　在基礎(chǔ)分子水

7、平上對HIV與肌動蛋白細胞骨架相互作用機制的研究，促進了病毒發(fā)病機理的理解。由于這種相互作用對于HIV-1感染CD4 T細胞也是至關(guān)重要的，因此也可為抗HIV-1藥物的研發(fā)提供新靶點。
　　方法：
　　一、研究對象
　　靜息CD4 T細胞:從正常人外周血中提取PBMC，并分選目的細胞。靜息CD4T細胞，使用抗體CD14、CD56、HLA-DR、CD8、CD11b/Mac-1、CD19進行負選;靜息記憶CD4 T細胞，使

8、用抗體CD14、CD56、HLA-DR、CD8、CD11b/Mac-1、CD19、CD45RA進行負選。參與本課題研究的所有志愿者均簽署了知情同意書，并通過了中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。
　　二、實驗方法
　?。ㄒ唬└腥拘钥寺〉闹苽?br>　　質(zhì)粒提取:按質(zhì)粒大提試劑說明書提取NL43及AD8質(zhì)粒，保存于-20℃。轉(zhuǎn)染前一天，將293T細胞鋪至100cm2培養(yǎng)皿中（3*106/皿）;12～24小時后，細胞80％～

9、90％融合可進行轉(zhuǎn)染;將20ug質(zhì)粒DNA(NL43或AD8)和60ul LP2000混合至DMEM培養(yǎng)基中，加至前一天鋪好的293T細胞中，6小時后換D10培養(yǎng)基，37℃/5％CO2培養(yǎng)48小時后收獲上清，即制備好的感染性克隆，于-135℃冰箱保存。
　?。ǘ㏄BMC中分選靜息CD4 T/Memory CD4 T細胞
　　正常人PBMC提取后，使用Dynabeads及相應(yīng)抗體(CD14、CD56、HLA-DR、CD8、C

10、D11b/Mac-1、CD19、CD45RA)通過陰性選擇方法分選出Reating CD4 T/Resting Memory CD4 T細胞，計數(shù)后以R10培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1*106/ml，置于T25培養(yǎng)瓶中，CO2培養(yǎng)箱37℃過夜培養(yǎng)，第二天進行后續(xù)實驗。
　?。ㄈ┧幬锾幚砗蟮募毎径緦嶒?br>　　將前一天分選好的靜息（記憶）CD4 T細胞以1*106/ml濃度分裝至流式管中，藥物(AZT、R10015、CK548等)處

11、理1小時（培養(yǎng)箱）后，加入感染性克隆(NL43或AD8)，2小時（培養(yǎng)箱）后R10洗去病毒及藥物（離心350g，5min），每管補R10至1ml，每天加入1ul IL-7(10ng/ul)，37℃/5％CO2培養(yǎng)。
　　結(jié)果：
　　一、 CCR5信號轉(zhuǎn)導通路在HIV-1感染過程中的作用
　　1、為明確HIV-1感染靜息記憶CD4 T細胞的過程，是否受到HIV-CCR5信號通路的調(diào)節(jié)，首先使用PTX對CCR5通路進行阻斷

12、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTX處理過的細胞中，病毒復制受到抑制。
　　2、進一步對細胞中肌動蛋白運動狀態(tài)進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)HIV-CCR5信號能夠誘導靜息記憶CD4 T細胞中肌動蛋白的動態(tài)變化。利用Jas對細胞內(nèi)肌動蛋白進行固定后，發(fā)現(xiàn)HIV復制也受到抑制，提示靜息記憶CD4 T細胞中病毒復制受到肌動蛋白運動的調(diào)節(jié)。
　　3、為進一步明確HIV-CCR5信號是通過下游哪條通路對HIV感染進行調(diào)節(jié)，我們又使用了LIMK抑制劑R10015和Arp

13、2/3抑制劑CK548分別對兩條通路進行抑制，同樣發(fā)現(xiàn)HIV復制受到抑制，進而我們得出結(jié)論:HIV-CCR5信號能夠通過調(diào)節(jié)下游“LIMK-Cofilin”和“WAVE2-Arp2/3”兩條通路來影響病毒在靜息記憶CD4 T細胞中的復制。
　　二、細胞表面CD2分子在HIV-1感染過程中的作用
　　1、為明確HIV感染靜息CD4T細胞的過程是否受到來自CD2信號的調(diào)節(jié)，我們首先使用CD2抗體對細胞進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD2抗體

14、幾乎能夠完全抑制病毒在細胞中的復制，且CD2的配體CD58對病毒的復制也有類似的抑制作用。
　　2、進一步明確CD2對病毒感染的抑制作用是否是由細胞表面輔助受體表達下降所引起，我們發(fā)現(xiàn)CD2抗體處理過的細胞，表面CD4和CXCR4受體表達均有下降，且HIV進入細胞的能力有所下降;此外CD2抗體處理過的細胞中，HIV DNA合成明顯下降。
　　3、我們還發(fā)現(xiàn)CD2抗體對細胞內(nèi)肌動蛋白有明顯的極化作用，且能夠使細胞內(nèi)eofili

15、n進一步失活。由此我們得出結(jié)論:CD2能夠通過調(diào)節(jié)T細胞表面CD4和CXCR4受體表達，抑制病毒進入細胞;并通過改變actin的極化狀態(tài)，影響病毒在細胞內(nèi)的復制。
　　結(jié)論：
　　1、HIV-1通過結(jié)合輔助受體CCR5，激活下游“LIMK-Cofilin”和“WAVE2-Arp2/3”兩條信號轉(zhuǎn)導通路，來調(diào)節(jié)病毒感染。
　　2、CD2能夠通過調(diào)節(jié)靜息CD4 T細胞表面CD4/CXCR4受體表達以及通過改變actin的極