Cd3001f基因修飾樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠氣道炎癥的作用研究.pdf

1、過(guò)敏性哮喘是以氣道高反應(yīng)性(airwayhypersensitivity，AHR)、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn)以及血清高水平IgE為特征的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病。目前研究認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞優(yōu)勢(shì)性分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2類細(xì)胞因子在過(guò)敏性哮喘的引發(fā)中扮演著重要角色。
　　 Cd3001f(CD300antigenlikefamilymemberF)分子是一個(gè)氨基端帶有信號(hào)肽、胞外段帶有IgV樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)

2、、胞內(nèi)段帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(immune-receptortyrosine-basedinhibitorymotifs，ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序(immune-receptortyrosine-basedswitchingmotif，ITSM)的I型糖蛋白，有研究顯示，阻斷或沉默樹(shù)突狀細(xì)胞表面Cd3001f分子的表達(dá)能夠促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞啟動(dòng)的T細(xì)胞增殖以及抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答，表明Cd3001f分子具有負(fù)向調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞

3、啟動(dòng)T細(xì)胞應(yīng)答的功能。
　　 在本研究中，我們根據(jù)GenBank提供的小鼠Cd3001f基因核酸序列(NM145634.3)，設(shè)計(jì)含完整開(kāi)放閱讀框(openreadingframe，ORF)的Cd3001f基因特異性引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)從小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(bonemarrow-deriveddendritic

4、cells，BMDCs)中擴(kuò)增得到Cd3001f基因，將其與pMD-18T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-Cd3001f。經(jīng)生物信息學(xué)分后，設(shè)計(jì)特異性引物以重組質(zhì)粒pMD-Cd3001f為模板聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)擴(kuò)增Cd3001f基因編碼區(qū)不合信號(hào)肽的胞外段，將其與pGEX-4T-3載體連接構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Cd3001f(22aa-185aa)。原核表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ros

5、etta(E3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了約45.5kD的GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GSTrapFF親和層析柱純化后皮下免疫接種新西蘭大白兔，制備了抗GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)結(jié)果顯示，其抗體效價(jià)高達(dá)1:16384。將Cd3001f基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(h

6、umanembryonickidney293cells，HEK293)，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(indirectimmunofluorescenceassays，IIFA)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot)檢測(cè)兔抗GST-Cd3001f(22-185aa)融合蛋白多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示，該多克隆抗體能夠特異性的識(shí)別Cd3001f真核表達(dá)蛋白。
　　 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)5對(duì)小鼠Cd3001f基因保守序列編碼短發(fā)卡R

7、NA(shorthairpinRNA，shRNA)的正義、反義寡核苷酸鏈，將其退火后分別克隆至pLL3.7質(zhì)粒載體中獲得Cd3001f基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法，分別將Cd3001f基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cd3001f基因真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-Cd3001f共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)。Real-timePCR分析顯示，重組質(zhì)粒pLL-Cd3001f-shRNAe對(duì)Cd3001f基因mRNA抑制率為75.6％。以重組質(zhì)粒

8、pMD18-Cd3001f為模板PCR擴(kuò)增Cd3001f基因，將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中。以重組質(zhì)粒pLL-Cd3001f-shRNAe為模板PCR擴(kuò)增含U6啟動(dòng)子的Cd3001f基因shRNA，將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack中。PmeⅠ酶切陽(yáng)性重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化含重組腺病毒骨架質(zhì)粒Adeasy-1的感受態(tài)菌BJ5183，進(jìn)行同源重組。PacⅠ酶切重組腺病毒載體后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12-18天，獲得重組

9、腺病毒Ad-Cd3001f、Ad-Cd3001f-shRNA。大量擴(kuò)增重組腺病毒，并采用CsCl密度梯度離心法進(jìn)行純化。重組腺病毒Ad-Cd3001f滴度為1.4×109PFU/ml，Ad-Cd3001f-shRNA滴度為2.6×109PFU/ml。以感染復(fù)數(shù)(amultiplicityofinfection，MOI)為75的重組腺病毒感染BMDCs48小時(shí)。Real-timePCR分析顯示，Ad-Cd3001f感染細(xì)胞中Cd3001f

10、基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高，而Ad-Cd3001f-shRNA感染細(xì)胞中Cd3001f基因mRNA表達(dá)水平下降達(dá)51.7%。Westernblot分析顯示，Ad-Cd3001f感染細(xì)胞特異性地表達(dá)了Cd3001f蛋白。
　　 分別于第0天、第14天給C57BL/6小鼠腹腔注射經(jīng)凝膠佐劑乳化的卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)，第二次致敏后10天OVA溶液連續(xù)激發(fā)3天。以MOI為75的重組腺病毒Ad-Cd3001f(DC

11、-Cd3001f)和Ad-Cd3001f-shRNA(DC-siCd3001f)分別感染培養(yǎng)5天的BMDCs24小時(shí)，再用OVA激發(fā)24小時(shí)。分別于OVA首次致敏前7天和致敏后3天小鼠腹腔注射DC-Cd3001f或DC-siCd3001f。最后一次激發(fā)后24小時(shí)，檢測(cè)氣道高反應(yīng)性。吉姆薩瑞氏染色行肺泡灌洗液炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。H&E和PAS染色觀察肺組織病理學(xué)變化。ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage

12、fluid，BALF)、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞中CD4+Foxp3+Tregs和CD4+IL-17A+Th17的百分比。研究結(jié)果顯示，DC-siCd3001f免疫哮喘小鼠后能夠減輕氣道高反應(yīng)性和肺組織炎癥，降低肺泡灌洗液和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌，提高脾細(xì)胞中CD4+Foxp3+Tregs的百分比，降低脾細(xì)胞中CD4+IL-17A+Th17的百分