急性T淋巴細胞白血病中LMO2基因重排的研究.pdf

1、目的:
　　1.檢測264例初診急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）患者LMO2基因重排的發(fā)生率，同時檢測重排陽性組和陰性組患者LMO2等9種原癌基因mRNA的表達水平，明確LMO2基因重排與其表達水平是否有相關性。另外，對部分患者進行NOTCH1等多種基因突變檢測及芯片-比較基因組雜交（array-CGH），明確LMO2基因重排和其他基因突變、DNA拷貝數(shù)變化之間的關聯(lián)性。
　　2.應用全基因組測序（WGS）技術檢測2例LM

2、O2基因重排陽性T-ALL患者的對手基因，并闡明致病機制。
　　方法:
　　1.收集264例初診T-ALL患者的骨髓細胞，應用短期培養(yǎng)法制備染色體懸液，采用 R顯帶進行核型分析。采用熒光原位雜交（FISH）技術和實時熒光定量聚合酶鏈反應（RQ-PCR）技術分別檢測264例T-ALL患者LMO2基因重排發(fā)生情況和49例 T-ALL患者 LMO2等9種原癌基因 mRNA表達水平。利用 DNA抽提試劑盒（Invitrogen公司生

3、產(chǎn)）抽提基因組DNA，應用PCR擴增基因組DNA，同時采用PCR產(chǎn)物雙向測序的方法分析88例T-ALL患者NOTCH1等疾病相關基因突變情況。對22例有足量DNA樣本的T-ALL患者，應用芯片-比較基因組雜交技術（array-CGH）檢測 DNA拷貝數(shù)變化。最終，綜合分析 LMO2基因重排、表達、基因突變、DNA拷貝數(shù)變化之間的關聯(lián)性。
　　2.收集2例LMO2基因重排陽性的T-ALL患者凍存的骨髓細胞，應用DNA抽提試劑盒（In

4、vitrogen公司生產(chǎn)）抽提基因組DNA，送檢至少4μgDNA于上海伯豪生物技術有限公司進行全基因組測序。通過該檢測公司對測序結果進行深入分析，明確2例T-ALL患者LMO2基因的對手基因，并分析其參與致病機制。
　　結果:
　　1.264例T-ALL患者中LMO2基因重排、基因表達、基因突變和array-CGH變化等情況
　　264例初診T-ALL患者經(jīng)FISH技術檢測，發(fā)現(xiàn)LMO2基因重排陽性的有24例，陽性率為

5、9.1％，其中男性21例，女性3例。12例病人通過核型分析發(fā)現(xiàn)有累及人類染色體11p12-13的異常，包括10例病人核型結果為常見的t(11;14)(p13;q11)（10/264，3.8%），2例病人核型結果為del(11p12)。本組T-ALL患者中，LMO2基因隱匿性重排比率為4.5%（12/264）。LMO2基因重排陽性組與陰性組患者相比較，年齡更?。?18歲）、血紅蛋白值、乳酸脫氫酶值、異常核型比例更高（P值均<0.05），而

6、在不同的性別、骨髓原始細胞比例、外周血白細胞及血小板水平方面，均無統(tǒng)計學差異（P值均>0.05）。
　　對于上述的24例LMO2基因重排陽性的T-ALL患者，我們同時應用由BAC克隆 RP11-242H9（標記紅色熒光素）和 RP11-256C2（標記綠色熒光素）制備而成的TCRA/D基因的探針行FISH檢查，結果發(fā)現(xiàn)，10例T-ALL患者核型結果中包含t(11;14)(p13;q11)，核型分析和 FISH驗證基本一致，另外有4

7、例 T-ALL患者也同時檢測出LMO2和TCRA-TCRD基因重排，提示隱匿性的t(11;14)(p13;q11)。24例LMO2基因重排陽性的T-ALL患者中，有14例（58.33%）患者明確為染色體易位 t(11;14)(p13;q11)，包含10例核型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的t(11;14)(p13;q11)和4例隱匿性的LMO2和TCRA-TCRD基因重排。
　　我們通過全基因組測序方法發(fā)現(xiàn)一例T-ALL患者同時存在LMO2和TCRB基

8、因重排，這一發(fā)現(xiàn)促使我們在上述24例LMO2基因重排陽性的T-ALL患者中進行TCRB基因重排的篩查。我們應用BAC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10制備的FISH探針行進一步檢查，發(fā)現(xiàn)2例T-ALL患者存在TCRB基因重排，包含上述的通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)的t（7;11）（q35;p13）,還有1例 T-ALL患者也同時檢測出 LMO2和TCRB基因重排。而該患者也檢測出了TCRA-TCRD基因重排，結合該患者的核型結

9、果中包含t(8;14)(q24;q11)，我們推測TCRA-TCRD基因重排并不是與LMO2基因斷裂融合而成的，而是與位于8q24的MYC基因發(fā)生了融合，我們應用了BAC克隆RP11-440N18制備的FISH探針進行驗證。結果與我們推測的一致，TCRA-TCRD基因與MYC基因發(fā)生了融合，而LMO2和TCRB基因發(fā)生了融合。
　　我們選取了49例（10例患者LMO2基因重排陽性，39例患者LMO2基因重排陰性）有足量凍存細胞的T

10、-ALL患者樣本，提取了足量的總RNA，逆轉成cDNA后進行LMO2、TAL1、LYL1、STAG2、SEPT1、TLX1、TLX3、LEF1、MEF2C(44例患者行MEF2C檢測)等9個T-ALL相關的癌基因的表達水平的檢測。結果發(fā)現(xiàn)，LMO2基因重排陽性組患者和陰性組患者相比較，LMO2（P=0.02）、LEF1（P=0.015）基因表達水平較高，而MEF2C（P=0.04）基因表達水平較低，其余6個基因表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異（P

11、>0.05）。
　　對于264例進行LMO2基因重排檢測的T-ALL患者，我們選取了88例有足量凍存細胞的患者樣本，提取了基因組 DNA，進行 LMO2、FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1等基因突變檢測。88例患者中，13例患者LMO2基因重排陽性，75例患者基因重排陰性。通過檢測，我們發(fā)現(xiàn)43例病人（48.9%）沒有檢測到突變，25例病人（28.4%）存在一個基因突變，20例病人（22.8%）有一個以上基因突變

12、。FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1基因突變分別在8/88(9.1%)、4/88(4.5%)、40/88(45.5%)、12/88(13.7%)和4/88(4.5%)的T-ALL患者中發(fā)現(xiàn)。其中，8例T-ALL患者中2例患者FBXW7基因突變單獨發(fā)生，另外6例同時存在NOTCH1基因HD區(qū)域基因突變。4例T-ALL患者檢測出IL7R基因6號外顯子的突變，該突變導致IL7R蛋白跨膜區(qū)域的氨基酸殘端P240–S246的插入

13、或者置換。NOTCH1基因突變在40例患者中檢測到：62.5%患者HD區(qū)域發(fā)生基因突變，25.0%患者PEST區(qū)域發(fā)生基因突變，7.5%患者基因突變發(fā)生區(qū)域在HD和PEST共同區(qū)域，另有5%患者基因突變發(fā)生在TAD區(qū)域。12例T-ALL患者PHF6基因突變發(fā)生情況如下：2例錯義突變，4例移碼突變，6例無義突變。其中2例患者在相同的堿基位置發(fā)生基因突變成終止密碼子，其他的基因突變類型文獻中均有過報道。4例T-ALL患者WT1基因突變發(fā)生情

14、況：1例患者在9號外顯子462位氨基酸發(fā)生了錯義突變（R462W），而其他的患者均在7號外顯子區(qū)域發(fā)生移碼突變。88例患者中，均未檢測到LMO2基因突變。但是，我們發(fā)現(xiàn)LMO2基因的2個SNP位點（rs2038602和 rs3740617）。而LMO2基因重排陽性患者和重排陰性患者，F(xiàn)BXW7(P=0.168)、IL7R(P=0.252)、NOTCH1(P=0.956)、PHF6(P=0.265)和 WT1(P=0.252)基因突變的發(fā)

15、生情況無明顯統(tǒng)計學差異。
　　對于22例有足量基因組DNA的T-ALL患者，我們進行了比較基因組雜交檢測，從而發(fā)現(xiàn)這些患者 DNA拷貝數(shù)的變化。通過檢測我們發(fā)現(xiàn)，22例 T-ALL患者有1種或以上的基因組水平的異常，一共有87種基因組水平的改變或者缺失，平均每個病人有3.9種異常。在這些異常中，發(fā)生率最高的是CDKN2A基因的缺失（36.4%,8/22）。融合基因SET-NUP214、 SIL-TAL1、 NUP214-ABL1的

16、發(fā)生率分別為13.6%（3/22）、9.1%（2/22）、4.5%（1/22）。我們發(fā)現(xiàn)多種參與到白血病疾病發(fā)生發(fā)展的基因DNA拷貝數(shù)變化，如MYB基因的擴增(1/22,4.5%)，CDKN2A(8/22,36.4%)、WT1(3/22,13.6%)、LEF1(2/22,9.1%), LMO2(2/22,9.1%)、RB1（1/22,4.5%）、PHF6（1/22,4.5%）、ETV6（1/22,4.5%）等基因的缺失。我們用BAC克隆

17、RP11-646J21和RP11-278N12制備的FISH探針，驗證出array-CGH發(fā)現(xiàn)的2例T-ALL患者中LMO2基因上游的微缺失。
　　2.2例LMO2基因重排陽性的T-ALL患者LMO2對手基因研究情況
　　通過全基因組測序檢測及后期結果驗證，發(fā)現(xiàn)病例1的LMO2基因所在的11號染色體與TCRB基因所在的7號染色體同時發(fā)生了斷裂并重新連接，因此初步推測為染色體易位t(7;11)(q35;p13)。我們首先應用B

18、AC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10檢測病例1是否發(fā)生了TCRB基因重排，結果顯示該病例TCRB基因重排陽性。接著，我們根據(jù)全基因組測序的結果分別應用BAC克隆RP11-646J21和RP11-114L10檢測該病例是否同時發(fā)生LMO2基因和TCRB基因融合，結果顯示為融合陽性。我們設計出LMO2基因融合位置的PCR引物，經(jīng)過基因組DNA水平的PCR及PCR產(chǎn)物測序，我們發(fā)現(xiàn)病例1確實為染色體易位t(7;11)(q3

19、5;p13)，LMO2基因的對手基因為TCRB基因。病例2的LMO2基因所在的11號染色體與14號染色體長臂3區(qū)2帶同時發(fā)生了斷裂并重新連接，因此初步推測為染色體易位 t(11;14)（p13;q32）。該患者14q32區(qū)域斷裂位點位于BCL11B基因下游，我們根據(jù)全基因組測序的結果分別應用BAC克隆RP11-2348N10和RP11-74H1檢測該病例是否發(fā)生BCL11B基因重排，結果顯示為重排陽性。因此，病例2同時發(fā)生了LMO2和B

20、CL11B基因重排，LMO2基因的對手基因為BCL11B基因。我們設計出LMO2基因融合位置的PCR引物，經(jīng)過基因組 DNA水平的PCR及 PCR產(chǎn)物測序，我們發(fā)現(xiàn)病病例2確實為t(11;14)(p13;q32)。
　　結論:
　　1．本試驗通過對T-ALL患者中LMO2基因重排進行篩選，發(fā)現(xiàn)在T-ALL中LMO2基因重排是一種再現(xiàn)性較高的事件，LMO2基因重排陽性的T-ALL患者該基因表達也相對較高，LEF1基因表達具有相

21、互促進的作用。LMO2基因重排與NOTCH1等基因突變之間無相關性，提示T-ALL患者中LMO2基因重排是主要遺傳學事件。
　　2．通過全基因組測序技術對2例LMO2基因重排陽性的T-ALL患者進行LMO2基因斷裂位點的精確定位和對手基因的檢測，發(fā)現(xiàn)了在T-ALL中一種新的染色體易位t（11;14）（p13;q32）以及LMO2基因的對手基因-BCL11B。這種新的易位通過與BCL11B基因3’端的增強子的并置，導致LMO2基因的