急性T淋巴細(xì)胞白血病中LMO2基因重排的研究.pdf

1、目的:
　　1.檢測(cè)264例初診急性T淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）患者LMO2基因重排的發(fā)生率，同時(shí)檢測(cè)重排陽(yáng)性組和陰性組患者LMO2等9種原癌基因mRNA的表達(dá)水平，明確LMO2基因重排與其表達(dá)水平是否有相關(guān)性。另外，對(duì)部分患者進(jìn)行NOTCH1等多種基因突變檢測(cè)及芯片-比較基因組雜交（array-CGH），明確LMO2基因重排和其他基因突變、DNA拷貝數(shù)變化之間的關(guān)聯(lián)性。
　　2.應(yīng)用全基因組測(cè)序（WGS）技術(shù)檢測(cè)2例LM

2、O2基因重排陽(yáng)性T-ALL患者的對(duì)手基因，并闡明致病機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集264例初診T-ALL患者的骨髓細(xì)胞，應(yīng)用短期培養(yǎng)法制備染色體懸液，采用 R顯帶進(jìn)行核型分析。采用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）技術(shù)分別檢測(cè)264例T-ALL患者LMO2基因重排發(fā)生情況和49例 T-ALL患者 LMO2等9種原癌基因 mRNA表達(dá)水平。利用 DNA抽提試劑盒（Invitrogen公司生

3、產(chǎn)）抽提基因組DNA，應(yīng)用PCR擴(kuò)增基因組DNA，同時(shí)采用PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序的方法分析88例T-ALL患者NOTCH1等疾病相關(guān)基因突變情況。對(duì)22例有足量DNA樣本的T-ALL患者，應(yīng)用芯片-比較基因組雜交技術(shù)（array-CGH）檢測(cè) DNA拷貝數(shù)變化。最終，綜合分析 LMO2基因重排、表達(dá)、基因突變、DNA拷貝數(shù)變化之間的關(guān)聯(lián)性。
　　2.收集2例LMO2基因重排陽(yáng)性的T-ALL患者凍存的骨髓細(xì)胞，應(yīng)用DNA抽提試劑盒（In

4、vitrogen公司生產(chǎn)）抽提基因組DNA，送檢至少4μgDNA于上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。通過(guò)該檢測(cè)公司對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行深入分析，明確2例T-ALL患者LMO2基因的對(duì)手基因，并分析其參與致病機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.264例T-ALL患者中LMO2基因重排、基因表達(dá)、基因突變和array-CGH變化等情況
　　264例初診T-ALL患者經(jīng)FISH技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)LMO2基因重排陽(yáng)性的有24例，陽(yáng)性率為

5、9.1％，其中男性21例，女性3例。12例病人通過(guò)核型分析發(fā)現(xiàn)有累及人類染色體11p12-13的異常，包括10例病人核型結(jié)果為常見(jiàn)的t(11;14)(p13;q11)（10/264，3.8%），2例病人核型結(jié)果為del(11p12)。本組T-ALL患者中，LMO2基因隱匿性重排比率為4.5%（12/264）。LMO2基因重排陽(yáng)性組與陰性組患者相比較，年齡更?。?18歲）、血紅蛋白值、乳酸脫氫酶值、異常核型比例更高（P值均<0.05），而

6、在不同的性別、骨髓原始細(xì)胞比例、外周血白細(xì)胞及血小板水平方面，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均>0.05）。
　　對(duì)于上述的24例LMO2基因重排陽(yáng)性的T-ALL患者，我們同時(shí)應(yīng)用由BAC克隆 RP11-242H9（標(biāo)記紅色熒光素）和 RP11-256C2（標(biāo)記綠色熒光素）制備而成的TCRA/D基因的探針行FISH檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10例T-ALL患者核型結(jié)果中包含t(11;14)(p13;q11)，核型分析和 FISH驗(yàn)證基本一致，另外有4

7、例 T-ALL患者也同時(shí)檢測(cè)出LMO2和TCRA-TCRD基因重排，提示隱匿性的t(11;14)(p13;q11)。24例LMO2基因重排陽(yáng)性的T-ALL患者中，有14例（58.33%）患者明確為染色體易位 t(11;14)(p13;q11)，包含10例核型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的t(11;14)(p13;q11)和4例隱匿性的LMO2和TCRA-TCRD基因重排。
　　我們通過(guò)全基因組測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)一例T-ALL患者同時(shí)存在LMO2和TCRB基

8、因重排，這一發(fā)現(xiàn)促使我們?cè)谏鲜?4例LMO2基因重排陽(yáng)性的T-ALL患者中進(jìn)行TCRB基因重排的篩查。我們應(yīng)用BAC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10制備的FISH探針行進(jìn)一步檢查，發(fā)現(xiàn)2例T-ALL患者存在TCRB基因重排，包含上述的通過(guò)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的t（7;11）（q35;p13）,還有1例 T-ALL患者也同時(shí)檢測(cè)出 LMO2和TCRB基因重排。而該患者也檢測(cè)出了TCRA-TCRD基因重排，結(jié)合該患者的核型結(jié)

9、果中包含t(8;14)(q24;q11)，我們推測(cè)TCRA-TCRD基因重排并不是與LMO2基因斷裂融合而成的，而是與位于8q24的MYC基因發(fā)生了融合，我們應(yīng)用了BAC克隆RP11-440N18制備的FISH探針進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果與我們推測(cè)的一致，TCRA-TCRD基因與MYC基因發(fā)生了融合，而LMO2和TCRB基因發(fā)生了融合。
　　我們選取了49例（10例患者LMO2基因重排陽(yáng)性，39例患者LMO2基因重排陰性）有足量?jī)龃婕?xì)胞的T

10、-ALL患者樣本，提取了足量的總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行LMO2、TAL1、LYL1、STAG2、SEPT1、TLX1、TLX3、LEF1、MEF2C(44例患者行MEF2C檢測(cè))等9個(gè)T-ALL相關(guān)的癌基因的表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LMO2基因重排陽(yáng)性組患者和陰性組患者相比較，LMO2（P=0.02）、LEF1（P=0.015）基因表達(dá)水平較高，而MEF2C（P=0.04）基因表達(dá)水平較低，其余6個(gè)基因表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

11、>0.05）。
　　對(duì)于264例進(jìn)行LMO2基因重排檢測(cè)的T-ALL患者，我們選取了88例有足量?jī)龃婕?xì)胞的患者樣本，提取了基因組 DNA，進(jìn)行 LMO2、FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1等基因突變檢測(cè)。88例患者中，13例患者LMO2基因重排陽(yáng)性，75例患者基因重排陰性。通過(guò)檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)43例病人（48.9%）沒(méi)有檢測(cè)到突變，25例病人（28.4%）存在一個(gè)基因突變，20例病人（22.8%）有一個(gè)以上基因突變

12、。FBXW7、IL7R、NOTCH1、PHF6、WT1基因突變分別在8/88(9.1%)、4/88(4.5%)、40/88(45.5%)、12/88(13.7%)和4/88(4.5%)的T-ALL患者中發(fā)現(xiàn)。其中，8例T-ALL患者中2例患者FBXW7基因突變單獨(dú)發(fā)生，另外6例同時(shí)存在NOTCH1基因HD區(qū)域基因突變。4例T-ALL患者檢測(cè)出IL7R基因6號(hào)外顯子的突變，該突變導(dǎo)致IL7R蛋白跨膜區(qū)域的氨基酸殘端P240–S246的插入

13、或者置換。NOTCH1基因突變?cè)?0例患者中檢測(cè)到：62.5%患者HD區(qū)域發(fā)生基因突變，25.0%患者PEST區(qū)域發(fā)生基因突變，7.5%患者基因突變發(fā)生區(qū)域在HD和PEST共同區(qū)域，另有5%患者基因突變發(fā)生在TAD區(qū)域。12例T-ALL患者PHF6基因突變發(fā)生情況如下：2例錯(cuò)義突變，4例移碼突變，6例無(wú)義突變。其中2例患者在相同的堿基位置發(fā)生基因突變成終止密碼子，其他的基因突變類型文獻(xiàn)中均有過(guò)報(bào)道。4例T-ALL患者WT1基因突變發(fā)生情

14、況：1例患者在9號(hào)外顯子462位氨基酸發(fā)生了錯(cuò)義突變（R462W），而其他的患者均在7號(hào)外顯子區(qū)域發(fā)生移碼突變。88例患者中，均未檢測(cè)到LMO2基因突變。但是，我們發(fā)現(xiàn)LMO2基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)（rs2038602和 rs3740617）。而LMO2基因重排陽(yáng)性患者和重排陰性患者，F(xiàn)BXW7(P=0.168)、IL7R(P=0.252)、NOTCH1(P=0.956)、PHF6(P=0.265)和 WT1(P=0.252)基因突變的發(fā)

15、生情況無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　對(duì)于22例有足量基因組DNA的T-ALL患者，我們進(jìn)行了比較基因組雜交檢測(cè)，從而發(fā)現(xiàn)這些患者 DNA拷貝數(shù)的變化。通過(guò)檢測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，22例 T-ALL患者有1種或以上的基因組水平的異常，一共有87種基因組水平的改變或者缺失，平均每個(gè)病人有3.9種異常。在這些異常中，發(fā)生率最高的是CDKN2A基因的缺失（36.4%,8/22）。融合基因SET-NUP214、 SIL-TAL1、 NUP214-ABL1的

16、發(fā)生率分別為13.6%（3/22）、9.1%（2/22）、4.5%（1/22）。我們發(fā)現(xiàn)多種參與到白血病疾病發(fā)生發(fā)展的基因DNA拷貝數(shù)變化，如MYB基因的擴(kuò)增(1/22,4.5%)，CDKN2A(8/22,36.4%)、WT1(3/22,13.6%)、LEF1(2/22,9.1%), LMO2(2/22,9.1%)、RB1（1/22,4.5%）、PHF6（1/22,4.5%）、ETV6（1/22,4.5%）等基因的缺失。我們用BAC克隆

17、RP11-646J21和RP11-278N12制備的FISH探針，驗(yàn)證出array-CGH發(fā)現(xiàn)的2例T-ALL患者中LMO2基因上游的微缺失。
　　2.2例LMO2基因重排陽(yáng)性的T-ALL患者LMO2對(duì)手基因研究情況
　　通過(guò)全基因組測(cè)序檢測(cè)及后期結(jié)果驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)病例1的LMO2基因所在的11號(hào)染色體與TCRB基因所在的7號(hào)染色體同時(shí)發(fā)生了斷裂并重新連接，因此初步推測(cè)為染色體易位t(7;11)(q35;p13)。我們首先應(yīng)用B

18、AC克隆RP11-1084E14和RP11-114L10檢測(cè)病例1是否發(fā)生了TCRB基因重排，結(jié)果顯示該病例TCRB基因重排陽(yáng)性。接著，我們根據(jù)全基因組測(cè)序的結(jié)果分別應(yīng)用BAC克隆RP11-646J21和RP11-114L10檢測(cè)該病例是否同時(shí)發(fā)生LMO2基因和TCRB基因融合，結(jié)果顯示為融合陽(yáng)性。我們?cè)O(shè)計(jì)出LMO2基因融合位置的PCR引物，經(jīng)過(guò)基因組DNA水平的PCR及PCR產(chǎn)物測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)病例1確實(shí)為染色體易位t(7;11)(q3

19、5;p13)，LMO2基因的對(duì)手基因?yàn)門CRB基因。病例2的LMO2基因所在的11號(hào)染色體與14號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)2帶同時(shí)發(fā)生了斷裂并重新連接，因此初步推測(cè)為染色體易位 t(11;14)（p13;q32）。該患者14q32區(qū)域斷裂位點(diǎn)位于BCL11B基因下游，我們根據(jù)全基因組測(cè)序的結(jié)果分別應(yīng)用BAC克隆RP11-2348N10和RP11-74H1檢測(cè)該病例是否發(fā)生BCL11B基因重排，結(jié)果顯示為重排陽(yáng)性。因此，病例2同時(shí)發(fā)生了LMO2和B

20、CL11B基因重排，LMO2基因的對(duì)手基因?yàn)锽CL11B基因。我們?cè)O(shè)計(jì)出LMO2基因融合位置的PCR引物，經(jīng)過(guò)基因組 DNA水平的PCR及 PCR產(chǎn)物測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)病病例2確實(shí)為t(11;14)(p13;q32)。
　　結(jié)論:
　　1．本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)T-ALL患者中LMO2基因重排進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)在T-ALL中LMO2基因重排是一種再現(xiàn)性較高的事件，LMO2基因重排陽(yáng)性的T-ALL患者該基因表達(dá)也相對(duì)較高，LEF1基因表達(dá)具有相

21、互促進(jìn)的作用。LMO2基因重排與NOTCH1等基因突變之間無(wú)相關(guān)性，提示T-ALL患者中LMO2基因重排是主要遺傳學(xué)事件。
　　2．通過(guò)全基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)2例LMO2基因重排陽(yáng)性的T-ALL患者進(jìn)行LMO2基因斷裂位點(diǎn)的精確定位和對(duì)手基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了在T-ALL中一種新的染色體易位t（11;14）（p13;q32）以及LMO2基因的對(duì)手基因-BCL11B。這種新的易位通過(guò)與BCL11B基因3’端的增強(qiáng)子的并置，導(dǎo)致LMO2基因的