轉(zhuǎn)錄因子AIOLOS在急性B淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、目的:
　　1.檢測(cè)AIOLOS在兒童B-ALL中的表達(dá)，初步了解AIOLOS在ALL發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　2.構(gòu)建AIOLOS的慢病毒過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染Nalm-6細(xì)胞，為研究AIOLOS在ALL中的作用建立基礎(chǔ)。
　　3.研究AIOLOS過表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　4.闡明AIOLOS影響白血病細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.AIOLOS在B-ALL兒童骨髓白血病細(xì)胞

2、及白血病細(xì)胞系中表達(dá)水平的檢測(cè)
　　1.1收集36例B-ALL患兒及6例健康志愿者的骨髓標(biāo)本，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選CD19+的B淋巴細(xì)胞，采用RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)AIOLOS mRNA的表達(dá)水平。
　　1.2以白血病細(xì)胞系Ball-1、Nalm-6、Jurkat、Molt-4和K562為研究對(duì)象，以健康兒童B淋巴細(xì)胞為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting法分

3、別檢測(cè)AIOLOS在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　2.AIOLOS慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定
　　2.1通過RT-PCR方法從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中獲得AIOLOS基因全長，經(jīng)EcoR I和Mlu I雙酶切后，將AIOLOS基因片段與慢病毒表達(dá)載體pWPT-PURO-GFP連接重組為pWPT-PURO-AIOLOS。通過4質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，并以稀釋滴定法測(cè)定病毒滴度。
　　2.2慢病毒感

4、染B-ALL細(xì)胞系Nalm-6后，采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting法檢測(cè)AIOLOS在Nalm-6細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.AIOLOS過表達(dá)對(duì)Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　3.1將Nalm-6細(xì)胞分為三組:實(shí)驗(yàn)組，即AIOLOS過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組，稱為Nalm-6-AIOLOS;陰性對(duì)照組，即空載體轉(zhuǎn)染組，稱為Nalm-6-Mock;空白對(duì)照組，即未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Nalm-6細(xì)胞，稱為Na

5、lm-6-Control。
　　3.2細(xì)胞增殖:采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后7-11dNalm-6細(xì)胞的吸光度值，并繪制增殖曲線。
　　3.3細(xì)胞周期分布:利用碘化丙啶(PI)染色后，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nalm-6細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。
　　3.4細(xì)胞凋亡:采用AnnexinⅤ與PI雙染法，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。
　　3.5細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性檢測(cè):經(jīng)不同濃度的長春新堿(VCR)或柔紅霉素(DNR)作用24h后

6、，以CCK-8法檢測(cè)三組細(xì)胞的吸光度值，并計(jì)算各化療藥物的IC50值。
　　3.6細(xì)胞侵襲能力:以Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nalm-6細(xì)胞的侵襲能力;Nalm-6細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5共培養(yǎng)48 h后，應(yīng)用Matrigel管狀形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HS-5細(xì)胞的體外血管新生能力。
　　4.AIOLOS過表達(dá)影響Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制研究
　　4.1細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因和蛋白的檢測(cè):以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

7、檢測(cè)三組細(xì)胞中BCL-2、BAX、 P27、CyclinD3、C-MYC基因的表達(dá);以Western blotting法檢測(cè)三組細(xì)胞中BCL-2、P27、CyclinD3蛋白的表達(dá)。
　　4.2血管生成相關(guān)基因的檢測(cè):以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)三組細(xì)胞中VEGF、PLGF和ANG1基因的表達(dá);
　　4.3微陣列芯片檢測(cè)及基因芯片數(shù)據(jù)分析:應(yīng)用人類全基因組芯片，篩選Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞與Nalm-6-Mock細(xì)胞之間

8、的差異表達(dá)基因;并基于DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO聚類和KEGG通路分析。
　　4.4 PI3K/Akt信號(hào)通路:使用FlowCellect PI3K/MAPK Dual Pathway ActivationDetection Kit，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的活化情況。
　　4.5 Akt抑制劑對(duì)Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響:實(shí)驗(yàn)分為Nalm-6-AIOLOS、

9、Nalm-6-Mock、Nalm-6-Control及Nalm-6-AIOLOS+Akt抑制劑四組，以Western blotting法檢測(cè)四組細(xì)胞中Akt、磷酸化Akt（pAkt）蛋白的表達(dá)量;細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)四組細(xì)胞增殖，并繪制生長曲線;利用PI染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布;采用AnnexinⅤ與PI雙染法，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.AIOLOS在B-ALL兒童骨髓白血病細(xì)胞及白血

10、病細(xì)胞系中的表達(dá)水平
　　1.1正常兒童B淋巴細(xì)胞中AIOLOS基因主要有三種亞型，分別為AIO1、AIO2和AIO5。B-ALL患兒中AIOLOS基因的亞型分布與正常組無明顯差別。所有標(biāo)本中，AIO1亞型的表達(dá)頻率最高。B-ALL患兒組AIOLOS基因的表達(dá)水平較健康兒童低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但AIOLOS的表達(dá)水平與患兒性別、免疫分型和危險(xiǎn)度分組無明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。
　　1.2 B-ALL細(xì)胞系

11、Nalm-6中AIOLOS mRNA的表達(dá)水平較正常B淋巴細(xì)胞低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，相應(yīng)地，Nalm-6細(xì)胞中AIOLOS蛋白表達(dá)水平也較正常組低(P＜0.05)。
　　2.AIOLOS慢病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定
　　成功構(gòu)建了pWPT-PURO-AIOLOS慢病毒表達(dá)載體，測(cè)序鑒定結(jié)果與AIOLOS基因序列一致。在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝獲得的病毒滴度為3.23×108TU/ml，滿足實(shí)驗(yàn)要求。當(dāng)

12、感染復(fù)數(shù)(MOI)為100時(shí)，Nalm-6細(xì)胞感染率可達(dá)90％以上。轉(zhuǎn)染后的Nalm-6細(xì)胞，AIOLOS在mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　3.AIOLOS過表達(dá)對(duì)Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞的增殖速度明顯慢于Nalm-6-Control和Nalm-6-Mock(P＜0.05)。
　　3.2與Nalm-6-Control細(xì)胞相比，AI

13、OLOS過表達(dá)后，Nalm-6細(xì)胞在G0/G1期的比例由70.4％±2.39％升至84.1％±2.18％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而處于S期和G2/M期的細(xì)胞則分別由20.3％±0.94％和7.3％±0.81％（Nalm-6-Control）降至11.7％±0.78％和2.2％±0.56％(Nalm-6-AIOLOS)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Nalm-6-Control與Nalm-6-Mock在各細(xì)胞周期的比例

14、無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.3 Nalm-6-AIOLOS、Nalm-6-Mock與Nalm-6-Control總凋亡細(xì)胞比例分別為10.55％±0.67％，16.87％±0.52％，18.13％±0.51％，Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞凋亡較另外兩組細(xì)胞凋亡明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中，與Nalm-6-Control細(xì)胞（7.86％±0.52％）相比，Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞的晚期凋亡比

15、例（2.83％±0.67％）明顯減少(P＜0.05)。
　　3.4三組細(xì)胞對(duì)VCR或DNR的敏感性無明顯差異。相比于Nalm-6-Control，Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞對(duì)VCR和DNR24h的IC50值分別為19.91ng/ml(vs.18.44ng/ml)和3.62ng/ml（vs.3.22ng/ml），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.5 Tranwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，Nalm-6-AIOLOS與N

16、alm-6-Control在450nm波長處的吸光度值分別為0.11±0.05和0.14±0.06，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。體外血管新生實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Nalm-6-AIOLOS共培養(yǎng)后，HS-5細(xì)胞的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)形成較另外兩組增多。
　　4.AIOLOS過表達(dá)影響Nalm-6細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制研究
　　4.1與Nalm-6-Control相比，Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞中BCL-2基因表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)

17、，BA和CyclinD3基因表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而C-MYC和P27基因表達(dá)變化不大(P＞0.05); BCL-2與P27蛋白在三組細(xì)胞中的表達(dá)量相差不大(P＞0.05)，CyclinD3蛋白在Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞中的表達(dá)量明顯低于在另外兩組細(xì)胞中的表達(dá)量(P＜0.05)。
　　4.2與Nalm-6-Control組細(xì)胞相比，Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞的VEGF、PLGF和ANG1基因表達(dá)均上調(diào)了2倍以上

18、(P＜0.05)。
　　4.3基因芯片共篩選出差異表達(dá)基因278個(gè)，其中，Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞表達(dá)上調(diào)基因102個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因176個(gè);差異表達(dá)基因涉及的GO分類主要有生物學(xué)調(diào)控、代謝過程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等;差異表達(dá)基因涉及的KEGG通路主要有Pancreatic secretion、Neuroactive ligand-receptorinteraction、Small cell lung cance

19、r、Melanoma等。
　　4.4流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Nalm-6-AIOLOS中pAkt陽性細(xì)胞比例較Nalm-6-Mock與Nalm-6-Control組細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，Akt蛋白在三組細(xì)胞中的表達(dá)并無明顯差異，然而，Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞pAkt蛋白卻明顯高于另外兩組（P＜0.05）。另外，給予Akt抑制劑處理后，Nalm-6-AIOLOS組細(xì)胞Akt蛋白的表

20、達(dá)無明顯改變，但pAkt蛋白明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　4.5 Akt抑制劑可有效增加Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞的凋亡比例，但對(duì)Nalm-6-AIOLOS細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期分布無明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.B-ALL兒童白血病細(xì)胞中AIOLOS基因的表達(dá)水平減低;
　　2.AIOLOS過表達(dá)抑制了Nalm-6細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡;
　　3.AIOLOS過表