藥物提高心肌干細(xì)胞治療急性心肌梗死療效的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述:
　　摘要（一） 阿托伐他汀預(yù)處理提高心肌干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死療效的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:心肌干細(xì)胞(cardiac stem cells，CSCs)移植治療急性心肌梗死(acute myocardialinfarction，AMI)的療效受到存活率低和歸巢細(xì)胞數(shù)量少的限制?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)與其特異性受體趨化因子受

2、體4(CXCchemokine receptor4，CXCR4)構(gòu)成的SDF-1/CXCR4軸在CSCs遷移的過程中發(fā)揮重要作用;而PODXL(podocalyxin-like protein1，podocalyxin)是CSCs細(xì)胞膜上的一個(gè)表面標(biāo)記，被證實(shí)在細(xì)胞粘附和細(xì)胞間相互作用中發(fā)揮重要作用。本研究在體外缺氧無血清條件下模擬心肌缺氧微環(huán)境，研究阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)對(duì)小鼠CSCs的抗凋亡作用及可能發(fā)揮作用

3、的分子機(jī)制。此外，本研究旨在探討ATV預(yù)處理能否增加CSCs表面CXCR4和PODXL的表達(dá)，并提高其遷移能力及與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、穿越作用，進(jìn)而改善AMI后心功能。
　　方法:首先，分離培養(yǎng)小鼠CSCs，在缺氧無血清條件下用ATV處理12小時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡，并利用Western blot方法檢測(cè)通路蛋白AMPK、mTOR的磷酸化水平。其次，設(shè)置不同ATV濃度梯度組及時(shí)間梯度組，通過流

4、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CSCs細(xì)胞表面CXCR4和PODXL的表達(dá)比例，確定ATV促進(jìn)CSCs細(xì)胞表面CXCR4和PODXL表達(dá)的最佳濃度及時(shí)間。通過加入CXCR4的中和抗體及轉(zhuǎn)染PODXL-siRNA阻斷PODXL的表達(dá)進(jìn)行機(jī)制研究，進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組CSCs細(xì)胞遷移能力，與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和穿越能力。最后，在體實(shí)驗(yàn)中將320只雌性C57小鼠隨機(jī)分為sham組，AMI組，口服強(qiáng)化ATV組，移植CSCs組，移植A

5、TV預(yù)處理的CSCs(ATV-CSCs)組，口服強(qiáng)化ATV聯(lián)合移植ATV預(yù)處理的CSCs組(ATV+ATV-CS Cs組)，ATV預(yù)處理的轉(zhuǎn)染si-PODXL的CSCs組(ATV-PODXL-SiRNA-CSCs)組、ATV預(yù)處理的轉(zhuǎn)染si-CXCR4的CSCs組(ATV-CXCR4-SiRNA-CSCs)組。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型，梗死后1周經(jīng)頸靜脈注射各組處理的CSCs（2×105細(xì)胞/只），對(duì)照組動(dòng)物注射

6、等體積PBS。在干細(xì)胞移植后3天（基線）及4周（終點(diǎn)）分別行心臟超聲檢測(cè)、病理組織學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果:缺氧無血清條件引起明顯的細(xì)胞凋亡，ATV處理組細(xì)胞凋亡率顯著降低，且呈一定的濃度依賴性。ATV處理組AMPK磷酸化水平明顯升高，加入AMPK阻斷劑compound C可以顯著阻斷這種效應(yīng)。ATV可以劑量依賴性促進(jìn)CSCs表面CXCR4和PODXL的表達(dá)，在1μM ATV處理組和預(yù)處理12小時(shí)組表達(dá)比例最高。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

7、顯示，加入CXCR4的中和抗體后CSCs的遷移能力明顯下降， ATV促進(jìn)CSCs遷移的作用也被顯著抑制。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATV可以提高CSCs的粘附能力，而阻斷PODXL的表達(dá)，會(huì)顯著降低CSCs與細(xì)胞外基質(zhì)成分的粘附能力，同時(shí)也會(huì)明顯抵消ATV促進(jìn)CSCs細(xì)胞粘附的作用。在跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)中，與CSCs組相比，ATV預(yù)處理CSCs組穿越內(nèi)皮細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而轉(zhuǎn)染PODXL-siRNA的CSCs組細(xì)胞數(shù)量則顯著減少。
　

8、　結(jié)論:本研究結(jié)果表明ATV具有顯著的抗凋亡作用，可明顯提高CSCs在缺氧無血清條件下的存活率，其作用可能與AMPK/mTOR通路有關(guān)。使用ATV預(yù)處理的CSCs進(jìn)行細(xì)胞移植，可以通過提高CSCs細(xì)胞表面CXCR4和PODXL蛋白的表達(dá)地促進(jìn)其歸巢，改善AMI后心功能，聯(lián)合口服強(qiáng)化ATV和ATV預(yù)處理的CSCs可以進(jìn)一步提高CSCs移植的療效，為提高干細(xì)胞移植療效提供了一種新的可能思路。
　　摘要（二） 阿托伐他汀促進(jìn)急性心肌梗死

9、周邊心肌自噬抑制心肌凋亡的機(jī)制研究
　　目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)后局部心肌微環(huán)境惡劣，導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量丟失，我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，他汀可以對(duì)缺氧無血清條件下內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)是調(diào)控細(xì)胞能量代謝的核心分子，它可以抑制下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian tar

10、get of rapamycin，mTOR)活性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用。本研究擬應(yīng)用Wistar大鼠冠脈結(jié)扎制作AMI模型，給予AMPK抑制劑compound C和ATV進(jìn)行干預(yù)，對(duì)比觀察他汀早期干預(yù)，對(duì)梗死后心肌微環(huán)境的影響，明確ATV對(duì)梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)通路。
　　方法:將100只8周齡200-220gWistar大鼠隨機(jī)平均分為5組:sham組，AMI組，口服強(qiáng)化ATV組(ATV組)

11、，口服強(qiáng)化ATV并注射compound C組(ATV+CC組)，注射compound C組(CC組)。sham組手術(shù)線穿過前降支，但不結(jié)扎;其余各組開胸行前降支結(jié)扎，其中ATV(10mg/kg/d)和compound C(20mg/kg/w)從AMI模型制備當(dāng)天開始給予至取材。
　　結(jié)果:超聲數(shù)據(jù)顯示，與AMI組相比，口服ATV組的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)有明顯提高;組織病理學(xué)檢測(cè)顯示，與AMI組相比，口服ATV組的左室纖維化面積

12、和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，炎癥因子表達(dá)水平降低;此外，口服ATV組凋亡細(xì)胞明顯減少，自噬陽性細(xì)胞明顯增加。加入AMPK抑制劑compound C后ATV的這些保護(hù)作用均被顯著抑制。Western blot結(jié)果顯示，口服ATV組p-AMPK的表達(dá)水平較其他幾組明顯上調(diào)，而p-p53和p-mTOR的水平則明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠急性心梗后4周，ATV可以通過AMPK/mTOR通路顯著促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡;并且通過激活

13、AMPK/mTOR通路，ATV可以促進(jìn)心肌存活，減輕炎癥反應(yīng)，改善心功能。
　　摘要（三） 通心絡(luò)調(diào)節(jié)缺氧復(fù)氧條件下的人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白表達(dá)及功能的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:在缺血再灌注損傷中，心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelialcells，CMECs)通過微循環(huán)控制、旁分泌及近分泌、屏障保護(hù)三大功能在局部心肌組織中發(fā)揮保護(hù)作用。同時(shí)CMECs在缺血再灌注損傷時(shí)較心肌細(xì)胞更加

14、敏感，更易受到損傷。通心絡(luò)是一種由12種天然藥材構(gòu)成的中藥復(fù)方制劑，具有保護(hù)內(nèi)皮和防治心肌缺血再灌注損傷的功能。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過CMECs體外缺氧/復(fù)氧損傷模型和通心絡(luò)處理，采取TMT(Tandem mass tag)標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)譜方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中多種蛋白的變化以及通心絡(luò)的調(diào)節(jié)作用，以便從整體水平系統(tǒng)研究缺氧/復(fù)氧損傷對(duì)于CMECs細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響以及通心絡(luò)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:以不同濃度的通心絡(luò)處理心

15、臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，缺氧2小時(shí)，復(fù)氧2小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)分析凋亡率以確定通心絡(luò)作用的最佳濃度。通過TMT標(biāo)記的蛋白質(zhì)譜法檢測(cè)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生變化的蛋白及通心絡(luò)處理后變化的蛋白，并通過基因本體論分析及文獻(xiàn)綜述發(fā)生變化的蛋白的功能及參與的通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證差異蛋白功能，我們選取在缺氧/復(fù)氧和通心絡(luò)干預(yù)下有顯著變化的蛋白血紅素加氧酶-1(heme oxygenase1，HMOX1)和血管生成素-2(angiopoieti

16、n-2isoform c precursor, ANGPT2)，分別進(jìn)行抑制和過表達(dá)，通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，成管實(shí)驗(yàn)，增殖實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行功能學(xué)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:通心絡(luò)濃度依賴性地減少CMECs細(xì)胞凋亡，800μg/mL通心絡(luò)的抗凋亡作用最明顯。我們最終在三組中篩選出50個(gè)差異蛋白，并且進(jìn)一步分析了這些蛋白的功能及通路。缺氧/復(fù)氧顯著改變CMECs細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，而通心絡(luò)的干預(yù)會(huì)進(jìn)一步改變細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。與正常組相比，缺氧/復(fù)氧組下調(diào)了

17、30種蛋白的表達(dá)水平;而與缺氧/復(fù)氧組相比，通心絡(luò)干預(yù)組上調(diào)了6種蛋白的表達(dá)，下調(diào)了5種蛋白的表達(dá)。這些差異蛋白的功能主要包括細(xì)胞增殖，應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝等。我們選取了一些在缺氧/復(fù)氧條件下發(fā)揮重要作用的蛋白如HMOX1，ANGPT2等進(jìn)行進(jìn)一步分析。在缺氧/復(fù)氧條件下，通心絡(luò)顯著抑制CMECs細(xì)胞凋亡，促進(jìn)CMECs細(xì)胞增殖，遷移和成管。當(dāng)同時(shí)加入HMOX1抑制劑TiiPPIX或過表達(dá)ANGPT2時(shí)，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，發(fā)生增

18、殖和遷移的細(xì)胞數(shù)量，成管長(zhǎng)度及血管分支數(shù)均顯著減少。
　　結(jié)論:TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)譜檢測(cè)幫助我們從分子水平更深入的了解缺血再灌注損傷機(jī)制及通心絡(luò)的調(diào)節(jié)作用。我們確定了CMECs細(xì)胞內(nèi)與缺血再灌注損傷相關(guān)的50個(gè)差異蛋白，并分析了它們可能參與的多種功能調(diào)節(jié)及通路。缺血再灌注會(huì)顯著改變CMECs細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的表達(dá)，而通心絡(luò)干預(yù)會(huì)進(jìn)一步改變這些因子的水平，提示通心絡(luò)可能通過下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激因子，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)，發(fā)