磁標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、大量動(dòng)物和臨床試驗(yàn)表明骨髓干細(xì)胞移植能有效改善缺血心臟功能,但評(píng)價(jià)細(xì)胞植入、分布、存活、遷移的細(xì)胞標(biāo)記示蹤研究明顯滯后。利用磁共振(MR)活體示蹤技術(shù)評(píng)價(jià)心肌梗死干細(xì)胞治療的研究目前尚處于起始階段,尚存在許多亟待解決的問題。
　　 本研究立足于心臟病細(xì)胞治療中的示蹤熱點(diǎn),在優(yōu)化了豬急性心肌梗死模型的基礎(chǔ)上,采用超順磁性氧化鐵納米顆粒Resovist標(biāo)記豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs);對(duì)磁標(biāo)MSCs的體外、心肌內(nèi)移植MR影像學(xué)特點(diǎn)

2、、活體長期MR示蹤可行性進(jìn)行了詳細(xì)研究。
　　 體外研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Resovist可高效安全標(biāo)記細(xì)胞,MR信號(hào)能一定程度上反映磁標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量,Resovist顆粒在細(xì)胞內(nèi)停留時(shí)間約為2周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),磁共振成像對(duì)活體心肌內(nèi)移植的磁標(biāo)細(xì)胞具定位、相對(duì)定量價(jià)值,但磁共振無法區(qū)分細(xì)胞內(nèi)外鐵顆粒;磁共振長期活體細(xì)胞示蹤并不能反映細(xì)胞轉(zhuǎn)歸,可能與心肌組織無法及時(shí)清除磁標(biāo)細(xì)胞釋放的間質(zhì)鐵顆粒有關(guān)。量效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植治

3、療豬心肌梗死的療效呈劑量依賴性。
　　 第一部分冠脈結(jié)扎法制作豬急性心肌梗死模型的優(yōu)化
　　 目的:(1)比較前降支結(jié)扎坐標(biāo)(對(duì)角支vs.LAD百分位點(diǎn))對(duì)豬心肌梗死模型穩(wěn)定性的影響,以期指導(dǎo)研究者根據(jù)模型的心功能要求選擇合適的LAD結(jié)扎位置;(2)探討前降支結(jié)扎后發(fā)生室顫的特點(diǎn)及其相關(guān)因素,提高動(dòng)物成活率。
　　 方法:(1)47頭小型豬隨機(jī)分為兩組:A組(n=24)結(jié)扎LAD第二對(duì)角支開口遠(yuǎn)端;B組(n=23

4、)結(jié)扎LAD中遠(yuǎn)1/3交界處。分別于術(shù)前、術(shù)后1小時(shí)心臟超聲檢查左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),術(shù)后3天進(jìn)行常規(guī)冠脈造影,4周處死測量LAD結(jié)扎位點(diǎn)和梗死體積,并比較兩組間各指標(biāo)變異程度,用簡單直線回歸模型分析LAD結(jié)扎百分位點(diǎn)和心梗體積、LVEF相關(guān)性和回歸方程。(2)57只小型豬開胸結(jié)扎心臟LAD不同位點(diǎn),對(duì)室顫和體重、性別、術(shù)前心率、術(shù)前LVEF、開胸徑路(旁正中/肋間)、手術(shù)時(shí)間、結(jié)扎百分位點(diǎn)、術(shù)后心率、術(shù)后發(fā)生室早或短陣室速等因素進(jìn)

5、行單因素相關(guān)分析和Logistic回歸分析。
　　 結(jié)果:(1)B組結(jié)扎位點(diǎn)距離LAD開口長度、梗死體積、術(shù)后LVEF的變異較小;冠脈造影示對(duì)角支的開口、直徑和數(shù)量存在很大變異;LAD結(jié)扎百分位點(diǎn)和梗死心肌體積、術(shù)后LVEF均明顯相關(guān);線性回歸方程分別為:心肌梗死體積(％)=-0.54×結(jié)扎百分位點(diǎn)+48.06;術(shù)后LVEF(％)=0.56×結(jié)扎百分位點(diǎn)+10.49。(2)室顫均發(fā)生在結(jié)扎冠脈后35min內(nèi),高峰時(shí)間為結(jié)扎冠脈后

6、5min和20min;心率快于160bpm或慢于60bpm時(shí)容易誘發(fā)室顫。與非室顫組動(dòng)物比較,室顫組動(dòng)物的結(jié)扎位點(diǎn)高,術(shù)后最快心率＞60bpm的動(dòng)物較多,短陣室速發(fā)生率高。Logistic回歸分析顯示結(jié)扎位點(diǎn)過高是急性心肌梗死后發(fā)生室顫唯一的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)論:(1)由于對(duì)角支變異較大,以LAD全長為坐標(biāo)選擇合適的結(jié)扎百分位點(diǎn)可能是一種較為理想的豬心肌梗死模型建立方法。(2)結(jié)扎位點(diǎn)過高是豬急性心肌梗死后發(fā)生室顫的最重要

7、危險(xiǎn)因素;冠脈結(jié)扎后30min內(nèi)應(yīng)該嚴(yán)密心電監(jiān)護(hù),特別注意結(jié)扎冠脈后5min和20min二個(gè)時(shí)間點(diǎn)、＞160bpm或＜60bpm二種心率、以及短陣室速等先兆事件。
　　 第二部分豬間充質(zhì)干細(xì)胞的磁化標(biāo)記和體外MR成像
　　 目的:確定超順磁性氧化鐵納米顆粒Resovist標(biāo)記豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的合適方案,探討磁標(biāo)干細(xì)胞的體外MR成像特點(diǎn)、影響因素和鐵衰減特點(diǎn)。
　　 方法:分離培養(yǎng)鑒定豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后,首先用

8、不同Resovist濃度、不同共孵育時(shí)間標(biāo)記,根據(jù)標(biāo)記效率指標(biāo)(普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞鐵濃度測定、細(xì)胞透射電鏡檢查)和標(biāo)記毒性指標(biāo)(臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)、CCK-8試驗(yàn))確定適宜標(biāo)記條件。然后收集不同數(shù)量標(biāo)記細(xì)胞重懸于瓊脂糖EP管或?qū)⒓?xì)胞沉淀注入凝膠,進(jìn)行1.5TMR儀不同序列體外成像,分析體外鐵標(biāo)細(xì)胞的MR成像特點(diǎn)和檢測閾值。最后收集標(biāo)記后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度測定和MR成像,分析細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒衰減特點(diǎn)。
　　

9、結(jié)果:(1)權(quán)衡標(biāo)記效率和標(biāo)記毒性,“25:0.75μg/mlResovist-PLL24h標(biāo)記方案”和“50:1.5μg/mlResovist-PLL24h標(biāo)記方案”是比較合適的標(biāo)記策略。此二種方案標(biāo)記后,細(xì)胞內(nèi)鐵平均含量為(13.13±2.30)pg和(23.77±2.06)pg,普魯士藍(lán)染標(biāo)記率接近100％,電鏡檢查顯示胞質(zhì)內(nèi)含鐵致密顆粒囊泡,細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)未見破壞和毒性作用。(2)相比FSET2WI和FSET1WI,T2*WIfl

10、ash信號(hào)改變最為明顯;成像細(xì)胞數(shù)量越多,信號(hào)改變?cè)矫黠@。臨床用1.5TMR成像儀體外MRT2*WIflash檢測閾值為5×104～1×105個(gè)細(xì)胞。(3)隨著標(biāo)記后體外培養(yǎng)時(shí)間延長,細(xì)胞內(nèi)鐵逐漸減少,16d時(shí)鐵含量接近標(biāo)記前水平,12dMR信號(hào)強(qiáng)度和標(biāo)記前無差異.
　　 結(jié)論:“25:0.75μg/mlResovist-PLL24h標(biāo)記方案”和“50:1.5μg/mlResovist-PLL24h標(biāo)記方案”可高效標(biāo)記豬MSCs

11、;體外MR信號(hào)強(qiáng)度能一定程度上反映磁標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量;Resovist顆?？稍隗w外MSCs細(xì)胞內(nèi)停留2周左右時(shí)間。
　　 第三部分磁標(biāo)記豬間充質(zhì)干細(xì)胞心肌內(nèi)移植的體內(nèi)MR成像
　　 目的:探討活體心肌內(nèi)磁標(biāo)干細(xì)胞MR成像的特點(diǎn)和影響因素,研究MR成像對(duì)標(biāo)記細(xì)胞的定性、定量和定位價(jià)值。
　　 方法:“50:1.5μg/mlResovist-PLL24h標(biāo)記方案”磁化標(biāo)記豬骨髓MSCs,并用DAPI和PKH26進(jìn)行熒光

12、標(biāo)記。然后將MSCs經(jīng)心外膜直接注入豬急性梗死心肌內(nèi),每頭豬注射3點(diǎn)。根據(jù)每注射點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞是否鐵標(biāo)記,15頭豬隨機(jī)分成5組(每組n=3):2×106標(biāo)記細(xì)胞組、1×106標(biāo)記細(xì)胞組、5×105標(biāo)記細(xì)胞組、1×106未標(biāo)記細(xì)胞組和單純SPIO組。細(xì)胞移植后20～24h行豬心臟1.5TMR成像,包括快速自旋回波(FSE)T1WI和T2WI序列、快速小角度反轉(zhuǎn)梯度回波T2WI-flash、T2-MAP以及注射造影劑后的T2WI-fla

13、sh。1h后處死并根據(jù)MRI圖像切取心肌組織行普魯士藍(lán)染色和免疫熒光檢查。
　　 結(jié)果:(1)體外標(biāo)記:鐵標(biāo)記率為100％,DAPI和PK‰共陽性率達(dá)(93±5)％。(2)MRI:未標(biāo)記細(xì)胞組未顯示低信號(hào)區(qū);單純SPIO組和標(biāo)記細(xì)胞各組均可顯示低信號(hào)區(qū)。相比TrueFrsp序列、T1WI-FSE和T2WI-FSE序列,T2WI-flash序列能更清晰的顯示移植的磁標(biāo)記細(xì)胞;T2-MAP序列成像和釓噴酸葡胺注射后T2WI-flas

14、h序列成像,圖像質(zhì)量優(yōu)于單純T2WI-flash序列成像.可有效避免心電門控欠佳和呼吸心跳頻率影響。T2WI-flash結(jié)合TrueFrsp序列(或T1WI-FSE或T2WI-FSE序列),或者釓噴酸葡胺注射后T2WI-flash序列,或者采用T2-MAP成像序列,MR可判斷操作成功率。心臟T2WI-flash成像時(shí),心肌內(nèi)低信號(hào)區(qū)面積和回波時(shí)間呈線性相關(guān)。臨床用1.5TMRI儀至少可以探測到活體心臟內(nèi)5×105的細(xì)胞數(shù)量。在回波時(shí)間相

15、近或相同的情況下,注射點(diǎn)低信號(hào)區(qū)的面積大小與移植細(xì)胞數(shù)量顯著正相關(guān)。(3)組織學(xué)檢查:各標(biāo)記細(xì)胞組動(dòng)物MRI低信號(hào)區(qū)心肌病理學(xué)檢查見普魯士藍(lán)染色、DAPI和PKH26三重陽性細(xì)胞存在;無SPIO標(biāo)記細(xì)胞組注射部位心肌中存在DAPI和PKH26陽性細(xì)胞,單純SPIO組心肌注射點(diǎn)顯示細(xì)胞外游離的鐵顆粒。
　　 結(jié)論:應(yīng)用磁共振對(duì)超順磁性氧化鐵標(biāo)記的干細(xì)胞進(jìn)行活體心肌內(nèi)成像是可行的,具定位、相對(duì)定量價(jià)值,但無法區(qū)分細(xì)胞內(nèi)、外鐵顆粒。<

16、br>　　 第四部分磁標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性心肌梗死的磁共振長期示蹤和量效關(guān)系研究
　　 目的:量效關(guān)系是細(xì)胞移植治療心肌梗死療效評(píng)價(jià)中必不可少的組成部分,但文獻(xiàn)較少。細(xì)胞磁共振成像能否長期示蹤并真實(shí)反映移植細(xì)胞的遷移尚不清楚。本研究用MRI監(jiān)測不同劑量的磁標(biāo)MSCs移植治療豬急性心肌梗死,觀察移植細(xì)胞劑量和移植療效的關(guān)系,并探討MRI在示蹤干細(xì)胞中的價(jià)值。
　　 方法:開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈LAD建立豬急性心肌梗死模型,

17、將磁標(biāo)MSCs經(jīng)心外膜直接注入梗死交界區(qū)心肌內(nèi),每頭豬注射10點(diǎn)。根據(jù)移植細(xì)胞數(shù)量,15頭豬隨機(jī)分成3組:高劑量組(移植細(xì)胞量2×107,n=5)、中等劑量組(移植細(xì)胞量1×107,n=5)、低劑量組(移植細(xì)胞量5×106,n=5)。對(duì)照組僅注射DMEM(n=5)。細(xì)胞移植后24和1、3、6個(gè)月行豬心臟1.5TMR成像,采集心臟功能、測定梗死面積、移植細(xì)胞信號(hào)改變等信息。6個(gè)月處死,梗死區(qū)和梗死交界區(qū)切片進(jìn)行HE染色、Mallory染色

18、觀察組織細(xì)胞形態(tài)和纖維化情況:Ⅷ因子免疫熒光評(píng)價(jià)新生血管情況;Tunel法免疫組化觀察組織細(xì)胞凋亡情況;普魯士藍(lán)染色和CD68免疫組化觀察鐵顆粒狀態(tài)和心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的關(guān)系;
　　 結(jié)果:(1)磁共振心功能檢查發(fā)現(xiàn),對(duì)照組和低、中、高劑量組基線LVEF平均值分別為29.96％±1.45％、30.04％±2.20％、29.80％±2.82％和29.04％±1.60％。與對(duì)照組比較,移植3個(gè)月后低、中和高劑量組分別增加0.12％、

19、1.78％、3.72％和6.68％,隨訪6個(gè)月后分別增加-1.08％、1.82％、4.10％和7.24％。重復(fù)測量分析顯示心功能改善隨細(xì)胞劑量不同而不同,細(xì)胞劑量和心功能改善幅度相關(guān)。(2)細(xì)胞磁共振活體示蹤發(fā)現(xiàn)基本演變趨勢為:移植后3d呈邊界清晰的低信號(hào);隨后邊界模糊,面積擴(kuò)大,與正常交界的心內(nèi)膜緣呈低信號(hào);注射點(diǎn)對(duì)比度下降,并逐漸隱退或消失。組間比較發(fā)現(xiàn)劑量越高,顯示率越高,信號(hào)示蹤時(shí)間越長,細(xì)胞移行現(xiàn)象越明顯。(3)磁共振測量梗死

20、面積發(fā)現(xiàn),對(duì)照組和低、中、高劑量組的基線R心梗均值分別為18.50％±1.94％、19.78％±1.43％、18.96％±1-33％和19.48％±1.12％;與對(duì)照組比較,移植3個(gè)月低、中和高劑量組分別減少0.86％、3.16％、3.52％和5.24％,隨訪6個(gè)月后分別減少1.12％、3.72％、4.62％和6％。重復(fù)測量分析顯示,細(xì)胞劑量和梗死面積變化相關(guān)。(4)新生血管密度與移植細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān),梗死周邊區(qū)低、中和高劑量組新生血管

21、密度分別是對(duì)照組的1.35倍、2.89倍和4.71倍;梗死區(qū)低、中和高劑量組分別是對(duì)照組的1.23倍、2.36倍、4.18倍。(5)梗死以及梗死邊緣區(qū)凋亡指數(shù)(AI),對(duì)照組為4.2±1.0,低、中、高劑量組均顯著低于對(duì)照組,分別為2.4±1.7、1.3±1.2、0.8±1.1(P均＜0.05);有“劑量越大、凋亡越少”的趨勢,提示移植細(xì)胞不僅減少凋亡,與移植細(xì)胞數(shù)量可能相關(guān)。(6)普魯士藍(lán)染色和CD68免疫組化:絕大部分鐵顆粒游離于細(xì)