基于靜應(yīng)力加載腦組織切片探討血腫應(yīng)力誘導(dǎo)神經(jīng)損傷初步過(guò)程.pdf

1、出血性腦卒中是致死和致殘率最高的腦血管病，且預(yù)后多有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙等后遺癥。過(guò)去針對(duì)腦出血的研究大多以單一神經(jīng)元為靶點(diǎn)，考察其發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的生化損傷，如缺氧、興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、紅細(xì)胞裂解代謝產(chǎn)物、炎癥反應(yīng)等。除此之外，腦出血過(guò)程中還存在著瞬時(shí)血流沖擊應(yīng)力、剪切應(yīng)力以及血腫長(zhǎng)期的占位擠壓應(yīng)力（血腫應(yīng)力）等。而這些不容忽視的應(yīng)力在高血壓腦出血的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中是否發(fā)揮著重要作用，卻鮮有報(bào)道。因此本課題以腦組織切片（腦片）

2、為模型，重點(diǎn)探討了高血壓腦出血后，血腫應(yīng)力對(duì)組織損傷的初步過(guò)程，并通過(guò)神經(jīng)元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證?；谏锪W(xué)探討神經(jīng)組織損傷機(jī)制，能為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)出血性腦卒中發(fā)生發(fā)展的過(guò)程提供新的視角，能為該領(lǐng)域臨床干預(yù)和新藥研發(fā)提供新的思路。本文主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　?、贅?gòu)建并評(píng)價(jià)了腦片應(yīng)力加載培養(yǎng)體系。本課題采用微孔濾膜培養(yǎng)法，利用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室進(jìn)行腦組織切片培養(yǎng)，并以密閉應(yīng)力加載裝置對(duì)組織切片及細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)力加載，構(gòu)建了切片

3、及細(xì)胞應(yīng)力加載培養(yǎng)體系。通過(guò)正置相差顯微鏡、乳酸脫氫酶酶標(biāo)以及促凋亡基因 BAX定量 PCR等手段，對(duì)切片最佳培養(yǎng)條件、活性窗口期進(jìn)行考察。結(jié)果表明，切片最佳活性窗口期為2~6天，最佳換液時(shí)間間隔為24h，損傷應(yīng)力加載大小為40kPa。
　?、谔接懥遂o壓力對(duì)腦片損傷的初步過(guò)程。1）通過(guò)對(duì)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物神經(jīng)元烯醇化酶（NSE）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白（GFAP）以及神經(jīng)元骨架結(jié)構(gòu)蛋白β-III的免疫熒光染色，發(fā)

4、現(xiàn)在應(yīng)力加載后，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞活性減弱；2）采用熒光定量PCR技術(shù)分別對(duì)PIEZO家族、TRPV4等陽(yáng)離子通道基因的信使RNA（mRN A）在應(yīng)力加載前后進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明，應(yīng)力加載后，mRN A含量迅速上升，撤去應(yīng)力培養(yǎng)一段時(shí)間后mRN A含量再次顯著上升；3）通過(guò)westernblot技術(shù)分別測(cè)定了應(yīng)力加載前后PIEZO家族、TRPV4蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)量在應(yīng)力加載后迅速升高。與基因檢測(cè)的結(jié)果不同，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，

5、其表達(dá)量并沒(méi)有繼續(xù)升高，反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；4）PIEZO家族蛋白以及TRP V4陽(yáng)離子通道蛋白表達(dá)的上調(diào)，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外陽(yáng)離子濃度發(fā)生變。鈣離子熒光探針結(jié)果表明，應(yīng)力加載后，Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高。過(guò)高的胞內(nèi)Ga2+濃度將會(huì)激活促凋亡基因的表達(dá)；5）最后通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)應(yīng)力加載后促凋亡基因BAX以及抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA含量進(jìn)行檢測(cè)，以表征切片活性。結(jié)果顯示，應(yīng)力加載后，BAX基因mRNA含量迅速上升，

6、Bcl-2基因急劇下降，并在撤去應(yīng)力后仍然保持此趨勢(shì)，表明切片活性隨著在應(yīng)力加載后急劇下降，與免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　?、凵窠?jīng)元細(xì)胞應(yīng)力加載，進(jìn)一步補(bǔ)充和驗(yàn)證了基于腦片應(yīng)力加載的損傷途徑。實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)力加載后，培養(yǎng)體系中LDH濃度立即升高，而切片培養(yǎng)體系中LDH濃度先降低，再升高；TRPV4、PIEZO家族離子通道蛋白表達(dá)量迅速上升，撤去應(yīng)力后，其表達(dá)量立即下降。其次，靜壓力的加載，直接或間接的影響了骨架微管蛋白β-III的表達(dá)