牛大力總黃酮對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　本課題以環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠動物模型為實驗對象，對甜牛大力總黃酮(the total flavonoids of Radix Millettia Speciosa，RMSF)進行研究，觀察RMSF對免疫抑制小鼠免疫器官、細胞免疫、體液免疫和單核-巨噬系統(tǒng)等方面的影響，并比較甜、苦牛大力總黃酮(the total flavonoids ofRadix Millettia Championi，RMCF)對免疫抑制小鼠調(diào)節(jié)作

2、用及其作用機制的異同，為開發(fā)牛大力的藥用價值和推廣應用提供理論支撐。
　　方法:
　　1.以蘆丁為標準品，NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法檢測RMSF含量，通過靜態(tài)吸附-洗脫實驗篩選分離純化RMSF的大孔樹脂型號，結合單因素試驗優(yōu)化其分離純化工藝參數(shù)。
　　2.昆明種小鼠隨機分為正常對照組(生理鹽水10 mL/kg)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)模型組(生理鹽水10 mL/kg)、左

3、旋咪唑+CTX(levamisole，LMS)陽性對照組(20 mg/kg)、RMSF+CTX高、中、低劑量組(40、20、10 mg/kg)與RMCF+CTX高、中、低劑量組(40、20、10mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥21天，1d/次。并于給藥第1、2、8天，除正常對照組外，均腹腔注射(Intraperitoneal injection，i.p) CTX80 mg/kg制備小鼠免疫抑制模型。
　　3.探討RMSF對免疫抑制小鼠的

4、免疫調(diào)節(jié)作用，測定各組小鼠的體質(zhì)量變化、胸腺和脾臟指數(shù)、白細胞(white blood cell，WBC)數(shù)目、血清溶血素含量遲發(fā)型變態(tài)反應程度(delayed type hypersensitivity,DTH)和單核-巨噬細胞吞噬功能。
　　4.RMSF與RMCF在藥效方面比較，檢測免疫抑制小鼠WBC數(shù)目，胸腺和脾臟指數(shù);特異性的細胞免疫如DTH、T淋巴細胞增殖實驗;特異性的體液免疫如B淋巴細胞增殖實驗;非特異性免疫如碳廓清實

5、驗、脾臟中酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)和乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)活性。
　　5.蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)觀察小鼠脾臟和胸腺病理形態(tài)學的改變。
　　6.測定各組小鼠血清中細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達水平。
　　7.實時熒光定量PCR檢測不同給藥組對小鼠脾臟IFN-γ、T-bet、Gat

6、a-3 mRNA表達的影響。
　　結果:
　　1.以蘆丁為對照品，在510nm波長處采用紫外分光光度法測定RMSF含量為2.38 mg/g。通過單因素比較優(yōu)化RMSF的分離純化工藝條件，其最優(yōu)工藝條件為:采用AB-8大孔吸附樹脂進行純化工藝考察，pH為5.5，濃度為1.12 mg/mL的甜牛大力提取液在上樣速率為1.0mL/min的條件下，最大吸附率為80.2％;4 BV80％乙醇以1.0 mL/min的速率洗脫，按此條件純

7、化后的RMSF回收率達到52.5％，純度為64.6％。
　　2.實驗結果顯示，反映CTX組小鼠的固有免疫和適應性免疫的各種常用指標均有所下降(P＜0.01或P＜0.05)，說明免疫抑制小鼠的模型制備成功。
　　3.與CTX組比較，一定劑量的RMSF可不同程度提高模型小鼠的體質(zhì)量、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)(P＜0.01或P＜0.05);顯著提高模型小鼠的WBC(P＜0.01)數(shù)目;促進模型小鼠的DTH程度(P＜0.01）;提高模型小

8、鼠的血清溶血素含量(P＜0.05）;增加模型小鼠的單核巨噬細胞的吞噬功能(P＜0.01或P＜0.05)。
　　4.組織學與形態(tài)學觀察顯示，與CTX組比較，RMSF(40、20 mg/kg)、RMCF(40、20 mg/kg)的胸腺皮質(zhì)厚度和胸腺上皮細胞均顯著增加;RMSF(40、20、10 mg/kg)和RMCF(40 mg/kg)組紅髓與白髓分界清楚，脾小結生發(fā)中心明顯，淋巴細胞密度增加;提示RMSF、RMCF對CTX致小鼠脾臟

9、和胸腺組織發(fā)育損傷均有一定的改善作用。
　　5.RMSF與RMCF的藥效對比結果表明，與CTX組比較，一定劑量的RMSF和RMSF均可明顯提高免疫抑制小鼠的WBC數(shù)目(P＜0.01);不同程度提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)(P＜0.01或P＜0.05);促進免疫抑制小鼠的T、B淋巴細胞增殖能力(P＜0.01或P＜0.05)和DTH程度（P＜0.01）;提高免疫抑制小鼠的單核巨噬細胞的吞噬功能(P＜0.01或P＜0.05);增

10、強免疫抑制小鼠脾臟的ACP、LDH活性(P＜0.01或P＜0.05);不同程度提高免疫抑制小鼠血清中的IL-2、TNF-α和IFN-γ的水平(P＜0.01或P＜0.05)。其中，在提高WBC數(shù)方面，RMCF(40、20、10 mg/kg)較RMSF相應劑量組作用弱(P＜0.01或P＜0.05); RMCF(40、20 mg/kg)在提高T淋巴細胞增殖能力和DTH程度方面，弱于RMSF相應劑量組(P＜0.01或P＜0.05); RMCF(

11、40、20 mg/kg)提高IFN-γ的水平的能力弱于RMSF相應劑量組(P＜0.05);在提高廓清指數(shù)方面，RMCF(40 mg/kg)強于RMSF(40 mg/kg)(P＜0.05)。而在其余指標上，RMSF與RMCF作用差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　6.與CTX組比較，RMSF(40、20、10 mg/kg)均能提高CTX抑制的IFN-γ、T-bet水平(P＜0.01或P＜0.05); RMCF(40、20mg/k

12、g)同樣可使T-bet表達水平顯著性提高(P＜0.05)，但作用效果較RMSF對應劑量組弱(P＜0.01); RMCF(40、20、10mg/kg)和RMSF(40、20mg/kg)的GATA-3 mRNA表達量均呈顯著性降低(P＜0.01或P＜0.05)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　結論:
　　1.RMSF對免疫抑制小鼠特異性和非特異性免疫功能均呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性免疫調(diào)節(jié)作用。
　　2.RMSF和R