扶正抗艾方對免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)和CC、CXC類趨化因子的影響研究.pdf

1、目的:艾滋病是以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的致死性疾病，病死率極高，故艾滋病的防治是國際性的重大課題。由于艾滋病病毒的易變性，且缺乏適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?，致使疫苗研制面臨很大困難，防治艾滋病的藥物研究進(jìn)展緩慢。目前西醫(yī)對艾滋病的治療包括全身療法、抗機(jī)會性感染、抗繼發(fā)性腫瘤和抗HIV的綜合治療。由于艾滋病階段每日HIV復(fù)制達(dá)上百億，破壞宿主細(xì)胞上百萬，因此如何抑制乃至消滅人體內(nèi)HIV，一直是人們高度關(guān)注的焦點(diǎn)。雖然抗艾滋病藥能使病毒載量大幅度下

2、降，但不能完全清除，停藥后易反彈；藥物的不良反應(yīng)較多并容易產(chǎn)生耐藥性；藥物價(jià)格雖然已大幅度下降，但由于終生用藥而不能承受，這些仍是有待解決的重要問題。在這種形勢下，中醫(yī)藥學(xué)引起了人們的關(guān)注。扶正抗艾方是在湖北省中醫(yī)院承擔(dān)的國家六五一九五攻關(guān)課題“中醫(yī)藥防治病毒性肝炎”的處方基礎(chǔ)上篩選組方。其主要藥物組成有黃芪、黨參等，具有扶助正氣、祛瘀解毒等作用，并以扶正為主，體現(xiàn)了中醫(yī)治病防病的觀點(diǎn)：“正氣存內(nèi)，邪不可干”。 本課題觀察扶正抗

3、艾方對免疫抑制小鼠外周血淋巴細(xì)胞Lymph計(jì)數(shù)、CD4百分?jǐn)?shù)值、CD8百分?jǐn)?shù)值、CD4/CD8，血清、脾臟懸液、胸腺懸液中白介素2(IL-2)、γ干擾素(IFN-γ)含量、趨化因子正常 T 細(xì)胞分泌激活因子(RANTES)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1-α(MIP1-α)含量，胸腺、脾臟指數(shù)及超微結(jié)構(gòu)，脾臟中RANTES-mRNA表達(dá)的影響，探討本方對免疫抑制小鼠免疫功能提高的機(jī)理，為拓寬本方的臨床應(yīng)用和藥物開發(fā)提

4、供科學(xué)的理論依據(jù)。 方法: BALB/c小鼠80只，雄性，隨機(jī)分8組(正常對照組一、正常對照組二、模型對照組一、模型對照組二、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組)，除正常對照組外，余6組均用氫化可的松 HC 造模，25mg/只/天，連續(xù)腹腔注射7天后，取正常對照組一和模型對照組一小鼠，稱重(g)后摘眼球取血測外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，摘胸腺和脾臟稱濕重并計(jì)算臟器指數(shù)(胸腺、脾臟濕重mg/體重g)，以檢測造模成功與否，若模型對照組鼠外周血

5、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、臟器指數(shù)與正常對照組比較有差異(P<0.05)，說明造模成功。造模成功以后，模型對照組、中藥高、中、低劑量組、西藥對照組用20mg/只/天維持四周；同時(shí)所有鼠用0.4ml/只/天的劑量灌胃4周(正常對照組、模型對照組灌服生理鹽水，中藥組分高、中、低三個(gè)劑量灌服扶正抗艾方，西藥對照組灌服香菇菌多糖片)。末次灌胃6小時(shí)后，摘眼球取血，檢測其外周血Lymph計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞法檢測CD4、CD8百分?jǐn)?shù)值及比值；摘取臟器胸腺、脾臟，酶

6、聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測鼠血清、脾臟懸液、胸腺懸液中IL-2、IFN-γ、趨化因子RANTES、SDF-1、MIP1-α的蛋白表達(dá)；稱小鼠體重及胸腺、脾臟的濕重，計(jì)算小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，電鏡下觀察胸腺、脾臟超微結(jié)構(gòu)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測脾臟中RANTES-mRNA表達(dá)。 結(jié)果: (1)正常對照組和模型對照組外周血中Lymph計(jì)數(shù)，脾臟和胸腺指數(shù)(脾臟、胸腺重量mg/鼠重量g)比較有非常顯著

7、性差異P<0.01，說明免疫抑制小鼠模型造模成功。 (2)外周血淋巴細(xì)胞Lymph計(jì)數(shù)模型對照組與中、西藥治療各組比較均有顯著性差異P<0.05，說明扶正抗艾方各劑量組和香菇茵多糖組均能夠增加免疫抑制小鼠外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，中藥中劑量組效果最明顯。 (3)外周血CD4、CD8百分?jǐn)?shù)值及CD4/CD8，模型對照組與正常對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明HC能抑制T淋巴細(xì)胞中CD4、CD8兩個(gè)亞群的數(shù)量；中藥中、低劑量

8、組、香菇菌多糖組與模型對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明中藥中、低劑量組、香菇菌多糖組能增加 T 淋巴細(xì)胞中 CD4、CD8 兩個(gè)亞群的數(shù)量，尤其是CD4的數(shù)量和CD4/CD8。 (4)胸腺懸液中IL-2、IFN-γ的OD值模型對照組與正常對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明HC能抑制免疫器官胸腺中IL-2、IFN-γ的分泌；中藥中、低劑量組、香菇菌多糖組與模型對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明中藥中、低劑量組、

9、香菇茵多糖組能增加胸腺中IL-2、IFN-γ的分泌；脾臟懸液中IL-2、IFN-γ的OD值模型對照組與正常對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明HC能抑制免疫器官脾臟中IL-2、IFN-γ的分泌；中藥中劑量組、香菇菌多糖組與模型對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明中藥中劑量組、香菇菌多糖組能增加胸腺中IL-2、IFN-γ的分泌；血清中IL-2、IFN-γ的OD值模型對照組與正常對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明HC能抑制外周

10、血中IL-2、IFN-γ的分泌；中藥中劑量組、香菇菌多糖組與模型對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明中藥中劑量組和香菇菌多糖組能增加外周血中IL-2、IFN-γ的分泌。 (5)小鼠脾臟、胸腺指數(shù)(脾臟、胸腺重量mg/鼠重量g)模型對照組與正常對照組比較有非常顯著性差異P<0.01，說明HC能抑制免疫器官中細(xì)胞的數(shù)量和重量；中藥中劑量組與模型對照組比較有非常顯著性差異P<0.01，說明中藥中劑量組能恢復(fù)免疫細(xì)胞的數(shù)量、體積；電

11、鏡觀察脾臟與胸腺的超微結(jié)構(gòu)見正常對照組的脾臟與胸腺中淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、正常，免疫抑制模型對照組的脾臟與胸腺淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)明顯差異，淋巴細(xì)胞染色質(zhì)變淺，免疫抑制組小鼠脾臟、胸腺細(xì)胞數(shù)量同倍數(shù)視野下與正常對照組比較明顯減少，細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，如核、漿比例增大，核固縮，線粒體空泡化，有個(gè)別胞核分裂等，通過使用中藥中劑量后，這種變化有不同程度的改善，如細(xì)胞數(shù)量變多，細(xì)胞器增加，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，功能表現(xiàn)有恢復(fù)現(xiàn)象等。 (6)小鼠

12、血清、脾臟懸液、胸腺懸液中趨化因子RANTES蛋白表達(dá)的OD值模型對照組與正常對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明免疫抑制小鼠外周血及免疫器官中RANTES的表達(dá)減少；中藥中劑量組與模型對照組比較有顯著性差異P<0.05，說明中藥中劑量組能增加外周血及免疫器官中趨化因子 RANTES 的蛋白表達(dá)；SDF-1、MIP-1α含量各組間無差異。 (7)電泳結(jié)果表明，RANTES基因相對表達(dá)量正常對照組>模型對照組，中藥高劑量組>中

13、藥中、低劑量組、香菇菌多糖組>模型對照組，說明中藥各劑量組和香菇菌多糖組均能不同程度增加RANTES的基因表達(dá)；半定量分析表明中藥高、中劑量組增能加小鼠脾臟中RANTES的基因表達(dá)。 結(jié)論: (1)中劑量的“扶正抗艾”方對于T淋巴細(xì)胞亞群CD4、CD8的百分?jǐn)?shù)值及CD4/CD8有明顯的升高調(diào)節(jié)作用，能夠明顯提高CD4的百分?jǐn)?shù)值含量及CD4/CD8的比值，說明本方能提高免疫抑制小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫功能； (2)“扶正

14、抗艾”方各劑量組及香菇菌多糖組均能夠誘生免疫抑制小鼠模型血清中和免疫臟器懸液中的IL-2和IFN-γ含量，中藥中劑量組效果更顯著；通過IL-2和IFN-γ的分泌增多，可提高患者體內(nèi)T細(xì)胞的數(shù)量和功能，增強(qiáng)免疫功能； (3)“扶正抗艾方”對氫化可的松所致免疫功能低下小鼠脾臟、胸腺重量指數(shù)有明顯的提高作用，能夠改善免疫抑制小鼠脾臟、胸腺超微結(jié)構(gòu)，說明本方從淋巴細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)量、體積各方面都具有免疫提高作用； (4)免疫抑制