RNA干擾人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞KGF基因?qū)π叵偕掀ぜ?xì)胞增殖的體外研究.pdf

1、目的:在血液科應(yīng)用放化療治療血液腫瘤成為最主要的治療途徑，但是化療及放療相關(guān)的胸腺損傷比較常見，有文獻(xiàn)報(bào)道，脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)胸腺的修復(fù)，但是目前機(jī)制尚不能明確，但有文獻(xiàn)指出脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而這種因子可以與位于胸腺上皮細(xì)胞的受體結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)胸腺上皮的增殖，本實(shí)驗(yàn)旨在研究，在體外條件下，脂肪干細(xì)胞修復(fù)放化療損傷的胸腺的修復(fù)有可能是通過角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子實(shí)現(xiàn)的。
　　方法：在無菌環(huán)境下分離提取

2、人的皮下脂肪組織，應(yīng)用眼科剪將其剪碎至1mm3小組織塊，應(yīng)用I型膠原酶及胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)行消化，制成單細(xì)胞懸液，按照一定細(xì)胞濃度分裝于若干培養(yǎng)瓶中，加入適量含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，定期換液，觀察原代細(xì)胞形態(tài)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　首先篩選使 KGF基因沉默的最佳siRNA序列。應(yīng)用 siRNA target Designer設(shè)計(jì)軟件，選擇評(píng)分最高的交予銳博公司構(gòu)建KGF-siR

3、NA-1、KGF-siRNA-2、KGF-siRNA-3、empty-siRNA四組siRNA，分別應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞分為5組即KGF-siRNA-1組、KGF-siRNA-2組、KGF-siRNA-3組、empty-siRNA4組以及空白對(duì)照組，有文獻(xiàn)指出在48小時(shí)后轉(zhuǎn)染效率最高，遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好，應(yīng)用QT-P

4、CR篩選最佳序列。
　　通過篩選，發(fā)現(xiàn)序列3(KGF-siRNA-3)沉默效率最佳，進(jìn)一步篩選KGF-siRNA-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞基因沉默的最佳濃度，分別應(yīng)用Lipofectamine RNAiMAX瞬轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染人的脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，分為6組：組一：20umol/L、組二：30umol/L、組三：50umol/L、組四：100umol/L、組五：空質(zhì)粒組、組六：空白對(duì)照組，、有文獻(xiàn)指出在4

5、8小時(shí)后轉(zhuǎn)染效率最高，遂在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好，應(yīng)用QT-PCR篩選最佳濃度。
　　應(yīng)用Western-blot檢測(cè)KGF基因沉默后48h及72h角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)。
　　誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并通過Brdu增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)KGF基因沉默后的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　將KGF基因沉默后的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞與人及小鼠的胸腺上皮細(xì)胞株在Transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)（人脂肪源性干細(xì)

6、胞位于小室的下層，胸腺上皮細(xì)胞位于小室上層）作為基因沉默組，將KGF基因正常表達(dá)的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞與人及小鼠的胸腺上皮細(xì)胞株在Transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)（方法同前）作為基因正常表達(dá)組，同時(shí)設(shè)單純?nèi)思笆笮叵偕掀ぜ?xì)胞株培養(yǎng)組，應(yīng)用Brdu增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定胸腺上皮細(xì)胞增殖，
　　近一步通過PI（碘化丙啶）單染的方法分析胸腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞6-8d后，細(xì)胞呈比較典型的

7、纖維狀，10-12d后鋪滿瓶底約90%左右。傳代后選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44陽(yáng)性率93.7%，CD34陽(yáng)性率為0.405%。
　　2.QT-PCR結(jié)果顯示：與空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染48小時(shí)KGF-siRNA-1、KGF-siRNA-2、KGF-siRNA-3的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)KGFmRNA水平分別下降了46.88%、30.12%、81.88%，其中KGF-siRNA-3對(duì)KGFmRNA的干擾作用最

8、明顯（P<0.05），而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較，差異無顯著性（P>0.05）。
　　3.進(jìn)一步篩選KGF-siRNA-3使人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞基因沉默的最佳濃度，Realtime PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48小時(shí)KGF-siRNA-3(0.2ug)、KGF-siRNA-3（0.3ug）、KGF-siRNA-3（0.5ug）、KGF-siRNA-3（1.0ug）的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞mRNA水平分別下降了33.22%、46.40

9、%、81.06%、42.35%，其中KGF-siRNA-3（0.5ug）轉(zhuǎn)染組對(duì)KGFmRNA表達(dá)干擾效果最明顯（P<0.05），而空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組比較，差異無顯著性(P>0.05)。
　　4.RNA干擾KGF基因沉默后，48小時(shí)檢測(cè)角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)，在基因沉默組、空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組分別為（0.223±0.007）、（0.881±0.009）、（0.894±0.004），空白對(duì)照組蛋白表達(dá)與空質(zhì)粒組無顯著性差異，P>0

10、.05，基因沉默組蛋白表達(dá)較空質(zhì)粒對(duì)照組下降76.17%， P<0.05，72小時(shí)在各組的表達(dá)為（0.184±0.008）、（0.916±0.006）、（0.931±0.005），空白對(duì)照組蛋白表達(dá)與空質(zhì)粒組無顯著性差異，P>0.05，基因沉默組蛋白表達(dá)較空質(zhì)粒對(duì)照組下降80.24%，P<0.05。
　　5.對(duì)基因沉默的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，誘導(dǎo)成脂結(jié)果顯示誘導(dǎo)14天的人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性，應(yīng)用Brdu方法測(cè)定結(jié)果顯

11、示脂肪干細(xì)胞連續(xù)增殖。
　　6.應(yīng)用Brdu增殖實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定基因沉默組，基因正常表達(dá)組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ?xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞增殖情況：第1天各組增殖情況為（24.6±0.7）%、（38.3±0.7）%、（18.6±0.5）%，第2天各組增殖情況為（34.8±0.6）%、（46.1±0.6）%、（28.9±0.3）%，第3天各組增殖情況為（40.6±0.5）%、（52.4±0.8）、（35.5±0.4）%，結(jié)果顯示基因正常表達(dá)組的

12、增殖高于基因沉默組，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.應(yīng)用Brdu增殖實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定基因沉默組，基因正常表達(dá)組及單純鼠胸腺上皮細(xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞增殖情況：第1天各組增殖情況為（21.7±0.2）%、（36.8±0.6）%、（19.1±0.6）%第2天各組的增殖情況為（30.4±0.4）%、（45.8±0.7）%、（24.9±0.6）%第3天各組增殖情況為（35.9±0.7）%、（51.8±0.6）%、（31.5±0.3）%

13、，結(jié)果顯示基因正常表達(dá)組的增殖高于基因沉默組，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　8.應(yīng)用PI單染分別測(cè)定基因沉默組、基因正常表達(dá)組及單純?nèi)诵叵偕掀ぜ?xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期，計(jì)算與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的S期細(xì)胞所占比例：第1天各組 S期細(xì)胞所占比例為（24.6±0.7）%、（38.3±0.7）%、（18.6±0.5）%，第2天各組 S期細(xì)胞所占比例為（34.8±0.6）%、（46.1±0.6）%、（28.9±0.3）%，第3天

14、各組S期細(xì)胞所占比例為（40.6±0.5）%、（52.4±0.8）%、（35.5±0.4）%，結(jié)果顯示第1～3天，基因正常表達(dá)組的 S期細(xì)胞所占比例均高于基因沉默組， P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　9.應(yīng)用PI單染分別測(cè)定基因沉默組、基因正常表達(dá)組及單純鼠胸腺上皮細(xì)胞株培養(yǎng)組胸腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期，計(jì)算與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的S期細(xì)胞所占比例：第1天各組 S期細(xì)胞所占比例為（23.6±0.6）%、（37.3±0.7）%、（19.6

15、±0.7）%，第2天各組S期細(xì)胞所占比例為（25.9±0.6）%、（45.1±0.6）%、（28.9±0.4）%，第3天各組S期細(xì)胞所占比例為（40.9±0.5）%、（53.4±0.8）%、（35.5±0.2）%，結(jié)果顯示第1～3天，基因正常表達(dá)組S期細(xì)胞所占比例均高于基因沉默組，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)胸腺上皮細(xì)胞增殖，這種增殖作用可能是通過分泌角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子完成的<