間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)PBC膽管上皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究.pdf

1、背景:原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種慢性膽汁淤積性自身免疫疾病。早期主要累及小葉間膽管及間隔膽管，肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（intrahepatic biliary epithelial cells，IBEC）在PBC的發(fā)病中起著重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有向肝細(xì)胞分化的潛能，也可以通過分泌生長因子修復(fù)損傷的組織。有研究證明MSC

2、s移植治療PBC是安全有效的。然而具體機(jī)制尚不清楚。
　　目的:探討MSCs對甘氨酸鵝脫氧膽酸(glycochenodeoxycholic acid，GCDC)造成膽管上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)作用及機(jī)制，為MSCs治療PBC提供依據(jù)。
　　方法:BEC體外培養(yǎng)后，經(jīng)不同濃度的GCDC作用不同時間后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測BEC AnnexinⅤ/7-ADD陽性凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在此基礎(chǔ)上，通過MSCs與損傷的BEC共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞

3、術(shù)檢測AnnexinⅤ/7-ADD凋亡百分?jǐn)?shù)、線粒體膜電位JC-1的表達(dá)及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)表達(dá)量。CCK-8法(cell counting kit8)檢測BEC的細(xì)胞活力，蛋白印跡法(WesternBlotting)檢測各組PBC特異性自身抗原丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(E2components of the pyruvate dehydrogenase complex，PDC-E2

4、)、凋亡相關(guān)蛋白天冬氨酸蛋白水解酶3/8/9（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspases）、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈(microtubule-associated protein-light chain3，LC3)的表達(dá)。免疫組織化學(xué)法染色各組BEC特異性標(biāo)記角蛋白19（cytokeratin-19，CK-19）。免疫熒光法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附(enzym

5、elinked immunosorbent assay，ELISA)檢測患者血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.GCDC可誘導(dǎo)BEC凋亡，1，000μM GCDC作用BEC2h、6h、24h后，與對照組相比凋亡細(xì)胞比例顯著增加，（37.6±5.5、74.2±4.0、62.6±7.7）％vs（6.0±0.5、16.0±4.3、16

6、.4±4.0）％，p＜0.001。2.MSCs與BEC共培養(yǎng)可以抑制GCDC引起的凋亡，（19.3±4.8）％vs（38.9±4.7）％，p＜0.05。MSCs可以部分緩解GCDC引起的BEC細(xì)胞線粒體膜電位的損傷，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;MSCs可部分抑制GCDC引起的BEC凋亡水解相關(guān)蛋白活化的Caspase8、Caspase9的表達(dá)。3.GCDC作用BEC后膽管上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CK19表達(dá)降低，而MSCs共培養(yǎng)后，CK-19的表達(dá)

7、增加。作為PBC特異性自身抗原的PDC-E2在GCDC處理后，與對照組相比，相對表達(dá)量顯著增加，（1.4±0.2）vs（0.7±0.1），(p＜0.05)，與MSCs共培養(yǎng)后，PDC-E2的相對表達(dá)量下降，(0.9±0.1)vs（1.4±0.2），(p＜0.05)。4.MSCs可抑制GCDC誘導(dǎo)的BEC自噬的激活。MSCs可以減少GCDC引起的LC3的表達(dá)。5.MSCs部分緩解GCDC對BEC細(xì)胞活力的影響。GCDC作用2h和6h可明顯

8、降低BEC的細(xì)胞活力，而MSCs共培養(yǎng)之后BEC的增殖能力有部分提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。6.MSCs共培養(yǎng)有緩解GCDC誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基表達(dá)的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。7.MSCs減少BEC上清VEGF的表達(dá)?；颊哐錠EGF的水平明顯高于健康對照組，(1128.0±650.4)pg/ml vs(92.6±39.8)pg/ml，(p＜0.05)。且在體外實(shí)驗(yàn)中MSCs共培養(yǎng)可顯著降低GCDC作用后BEC培養(yǎng)上清的VEGF表達(dá)