小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外對淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是骨髓基質(zhì)的祖先細(xì)胞，具有多向分化的能力。MSCs同時還具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs可以減少移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率并減輕其嚴(yán)重程度，能夠延長皮膚移植物的存活時間。目前有許多關(guān)于MSCs的免疫調(diào)節(jié)方面的報道，關(guān)于MSCs對淋巴細(xì)胞抑制效應(yīng)的研究尤其多，但是MSCs免疫抑制的機(jī)制目前并不清楚。 研究目的：本文探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對淋巴

2、細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法：常規(guī)分離培養(yǎng)BALB／c鼠的MSCs細(xì)胞，經(jīng)傳代3代后得到形態(tài)和免疫表型典型、具有多向分化特性的MSCs細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前用<'60>Co照射30Gy備用。從BALB／c鼠外周血和脾臟分離單個核細(xì)胞，經(jīng)體外常規(guī)純化后得到反應(yīng)淋巴細(xì)胞，在PHA、IL-2和ConA分別作用下，MSCs和淋巴細(xì)胞按1：4比例進(jìn)行混合培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時后，用MTT法檢測淋巴細(xì)胞的存活數(shù)量，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴

3、細(xì)胞表面CD3和Ly-43的表達(dá)。細(xì)胞凋亡檢測采用Hoechest 33258染色、Annexin V流式檢測和DNA電泳實(shí)驗(yàn)。提取淋巴細(xì)胞的mRNA進(jìn)行凋亡相關(guān)基因芯片的檢測，獲取可能參與凋亡的分子的信息。實(shí)時定量PCR檢測淋巴細(xì)胞核因子-KB的表達(dá)是否有變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，在PHA(5μg／mL和10μg／ml_，)、IL-2(500U／mL和1000U／mL_)、ConA(5μg／mL和10μg／m

4、L)分別作用下，加入MSCs的淋巴細(xì)胞組(L+MSCs組)A均值比未加MSCs的對照淋巴細(xì)胞組(L組)明顯減少，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示L+MSCs組CD3+Ly-43+淋巴細(xì)胞比例較對照L組減少，分別為15.8％、9％(PHA組)和5.3％、3.4％(IL-2組)。Hoechest 33258染色顯示L+MSCs組淋巴細(xì)胞有分裂的細(xì)胞核小塊出現(xiàn)；Armexin V檢測顯示L+MSCs組Annexin

5、 V+PI-淋巴細(xì)胞比例較對照L組增加，分別為6.3％、O.8％(18h)和24.4％、9.9％(42h)：DNA電泳顯示L+MSCs組出現(xiàn)典型的DNA ladder。凋亡相關(guān)基因芯片結(jié)果顯示96個被檢測基因中有15個表達(dá)上調(diào)，包括Fas、FasL和hrk； 32個表達(dá)下調(diào)，例如凋亡抑制物IAP-2、IAP-3、NAIP-2和NAIP-5。核因子-KB的RT-PCR結(jié)果顯示L+MSCs組的核因子-KB表達(dá)比L組有顯著增高。

6、結(jié)論：MSCs對淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，并使淋巴細(xì)胞表面活化標(biāo)記的Ly-43表達(dá)比例減少。多種細(xì)胞凋亡檢測證實(shí)，在MSCs存在下，淋巴細(xì)胞發(fā)生了凋亡現(xiàn)象。凋亡相關(guān)基因芯片檢測顯示某些凋亡相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了改變，如：Fas、：FasI、IAP-2、IAP-3等。RT-OPCR顯示NF-KB的表達(dá)發(fā)生了改變。這些基因有可能參與了：MSCs誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡過程。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)的祖先細(xì)胞，具有多向分化的能力。近年來