體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小腸上皮細(xì)胞IEC-6增殖的影響.pdf

1、小腸是人體重要的消化吸收器官，多種因素致小腸組織結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙等，小腸黏膜損傷修復(fù)的機(jī)制不明，因而在治療上未能取得滿(mǎn)意的效果。研究發(fā)現(xiàn)，小腸隱窩處存在著小腸上皮干細(xì)胞，它可以分化為吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、潘氏細(xì)胞等小腸上皮細(xì)胞，在上皮細(xì)胞正常的衰老死亡和病理?yè)p傷后，干細(xì)胞增殖、分化，在上皮修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。小腸上皮干細(xì)胞的增殖、分化行為受細(xì)胞基因及干細(xì)胞所處的微環(huán)境雙重因素影響，生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞基質(zhì)分子形成的

2、微環(huán)境提供了干細(xì)胞增殖與分化的必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。TGF-a、EGF、FGF-2、HGF、IGF、KGF等細(xì)胞因子在體內(nèi)外研究中均能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖。
　　 新近的研究發(fā)現(xiàn)，小腸黏膜損傷后，除了小腸本身具有強(qiáng)大的自我更新及損傷修復(fù)能力外，一些腸外來(lái)源的細(xì)胞如骨髓的細(xì)胞等也參與了其中的調(diào)節(jié)。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植入器官損傷的動(dòng)物體內(nèi)，可見(jiàn)損傷的器官內(nèi)有外源的細(xì)胞定植，MSC

3、s可向多種組織器官遷移定位并分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞，參與損傷組織器官的修復(fù)。MSCs起源于中胚層，具有多向分化的潛能，MSCs可以分泌大量的促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。目前，體內(nèi)研究表明骨髓MSCs能向受損的小腸粘膜遷移、定植、分化，分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)隱窩再生，并與小腸上皮干細(xì)胞相互作用，加速受損粘膜修復(fù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要從體外研究MSCs對(duì)損傷小腸上皮細(xì)胞的修復(fù)作用。分為

4、三部分。第一部分：采用全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)擴(kuò)增雄性SD大鼠的MSCs，為體外共培養(yǎng)研究做準(zhǔn)備；第二部分：大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞株IEC-6的鑒定及體外放射損傷模型的建立：第三部分：利用Transwell間接接觸共培養(yǎng)裝置進(jìn)行研究，觀(guān)察MSCs對(duì)正常及放射損傷IEC-6的影響。
　　 研究目的：
　　 1、探討通過(guò)全骨髓培養(yǎng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)大鼠MSCs的方法。
　　 2、鑒定大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6，建立放射損傷I

5、EC-6細(xì)胞模型。
　　 3、觀(guān)察體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)正常及放射損傷小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6凋亡與增殖的影響，探討MSCs參與小腸隱窩上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的作用機(jī)制，為MSCs治療損傷小腸提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究?jī)?nèi)容及方法：
　　 1、全骨髓培養(yǎng)法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。
　　 取3～4周齡雄性SD大鼠，沖出股骨及脛骨骨髓腔內(nèi)細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，用含10％胎牛血清的完

6、全培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代擴(kuò)增。流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光標(biāo)記的表面標(biāo)志CD29、CD44、CD34、CD45。
　　 2、大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞株IEC-6的鑒定及放射損傷模型的建立。
　　 應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)雙染色，鑒定IEC-6中腸干細(xì)胞蛋白水平的表達(dá)；行RT-PCR鑒定IEC-6中腸上皮細(xì)胞各基因RNA水平表達(dá)；分別給予IEC-6一次性8Gy、10Gy、12Gyβ射線(xiàn)，光鏡下觀(guān)察形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，選擇合適劑量，建立放

7、射損傷細(xì)胞模型，及觀(guān)察時(shí)間，為MSCs修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 3、共培養(yǎng)研究。
　　 IEC-6種植于6孔transwell板下室，用10％FCS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)融合至50％時(shí)，用1％FCS完全培養(yǎng)基同步誘導(dǎo)24小時(shí)，融合約70％，給予10Gyβ射線(xiàn)一次性照射，與種植在transwell上室中融合60％MSC及ASC共培養(yǎng)，共分5組，正常IEC-6組(IEC-6)，正常IEC-6與MSCs共培養(yǎng)組(IEC-6+MSCs)

8、，放射損傷IEC-6組(IEC-6/R)，放射損傷IEC-6與MSCs共培養(yǎng)組(IEC-6/R+MSCs)，放射損傷IEC-6與對(duì)照ASC共培養(yǎng)(IEC-6/R+ASC)。1d、3d、5d、7d分別用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和Tunel法檢測(cè)IEC-6凋亡率。FCM檢測(cè)周期中S期細(xì)胞所占百分比，PCNA染色，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)行增殖檢測(cè)，ELISA檢測(cè)各培養(yǎng)組上清液中HGF、EGF、FGF-2的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、

9、接種后2d后首次換液，貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)多角形、梭形、紡錘形等，第10d逐步形成細(xì)胞克隆。12d～16d后細(xì)胞融合成單層，達(dá)80％～90％，傳代后的細(xì)胞較原代貼壁、生長(zhǎng)快速。隨代數(shù)增加，細(xì)胞形態(tài)趨向均一，呈梭形為主，細(xì)胞克隆呈“漩渦狀”。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞均一性好，陽(yáng)性率：CD29 99.17±1.36％，CD44 98.24±1.01％，CD34 2.79±0.24％，CD45 1.69±0.19％。
　　 2、IEC-6表達(dá)腸

10、上皮干細(xì)胞基因Msi1、Hes1、Lgr5；短暫擴(kuò)增細(xì)胞基因Cdx2；吸收細(xì)胞基因Si；潘式細(xì)胞基因Lyz1；杯狀細(xì)胞基因TFF3；神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞基因ChgA。能較好的模擬體內(nèi)小腸隱窩上皮細(xì)胞。
　　 3、IEC-6放射損傷模型。
　　 融合80％IEC-6，予10Gy放射損傷后第3d達(dá)凋亡高峰，凋亡率為37.9±3.26％，光鏡下形態(tài)寬扁，細(xì)胞間隙變大，核皺縮、變圓、細(xì)胞膜棘突狀，貼壁細(xì)胞脫落，漂浮細(xì)胞增多，之后進(jìn)入修

11、復(fù)期，7d基本恢復(fù)正常形態(tài)。
　　 4、IEC-6與MSCs共培養(yǎng)。
　　 (1)MSCs與正常IEC-6共培養(yǎng)7d，與正常IEC-6單獨(dú)培養(yǎng)組相比，F(xiàn)CM檢測(cè)各組IEC-6中細(xì)胞周期S期百分比、PCNA染色、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 (2)與放射損傷IEC-6共培養(yǎng)，10 Gy放射后第3d IEC-6/R+MSCs中IEC-6 FCM和Tunel染色法凋亡率低于其余兩個(gè)對(duì)照組(P＜0.

12、05)，MSCs能減少I(mǎi)EC-6早期凋亡；5d、7d IEC-6/R+MSCs中IEC-6 PCNA染色百分比高于對(duì)照組(P＜0.05)，5dIEC-6/R+MSCs中IEC-6 S期百分比高于對(duì)照組(P＜0.05)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)示IEC-6/R+MSCs組IEC-6細(xì)胞生長(zhǎng)增殖高于對(duì)照組(P＜0.05)，MSCs能促進(jìn)其增殖修復(fù)；ELISA示IEC-6/R+MSCs組上清液中EGF表達(dá)在3d、5d、7d高于對(duì)照組(P＜0.05)，IE

13、C-6/R+MSCs上清液中HGF 1d、3d、5d、7d表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.05)，F(xiàn)GF-2各組間表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、采用全骨髓培養(yǎng)法可以在體外獲得較純的大鼠MSCs。
　　 2、IEC-6表達(dá)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞相關(guān)基因Msi1、Hes1、Lgr5、Cdx2、Lyz1、Si、TFF3、ChgA。
　　 3、經(jīng)10Gyβ射線(xiàn)一次性體外照射后，IEC-