雌激素受體及基質(zhì)金屬蛋白酶-9在宮腔粘連中的表達(dá)意義.pdf

1、研究背景：
　　宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)是最常見(jiàn)的子宮內(nèi)膜病變之一，近年來(lái)宮腔粘連的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)，1.7％的繼發(fā)性閉經(jīng)及40％的不孕癥患者均與宮腔粘連有關(guān)。宮腔粘連雖然不是惡性疾病，但是因其發(fā)病率逐漸增高，導(dǎo)致患者月經(jīng)異常、劇烈腹痛及生育功能障礙，宮腔粘連不僅改變子宮內(nèi)膜容受性，影響受精卵著床導(dǎo)致不孕，而且影響不孕癥患者接受輔助生殖技術(shù)助孕后的效果，給患者及家庭帶來(lái)身心及經(jīng)濟(jì)上的巨大

2、損害，嚴(yán)重危害家庭及社會(huì)的穩(wěn)定。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于宮腔粘連的發(fā)病機(jī)制有多種假說(shuō)，其中纖維細(xì)胞增生活躍學(xué)說(shuō)及低雌激素狀態(tài)學(xué)說(shuō)得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。雌激素是一種類固醇類激素，能促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，與雌激素受體相結(jié)合，就會(huì)發(fā)生變構(gòu)從而形成二聚體，然后與ER反應(yīng)元件相結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯并合成蛋白質(zhì)，刺激靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)子宮內(nèi)膜和間質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂，引起子宮內(nèi)膜基底層和功能層腺體、間質(zhì)和血管增生和增厚，參與子宮內(nèi)膜的增殖、修復(fù)，參與調(diào)節(jié)月經(jīng)的

3、周期性變化，并通過(guò)與多種細(xì)胞因子如MMPs、TGF、VEGF的調(diào)控來(lái)參與宮腔粘連的形成。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類依賴鋅離子的蛋白水解酶，是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)降解最重要的蛋白水解系統(tǒng)，MMP-9屬于MMPs中的第二大類-明膠酶，分子量為92Kda，是MMPs家族中分子量最大的酶，基因定位于20q11.2-q13.1，主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞，可分解明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ型膠原彈性纖維、破壞基底膜完整性，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、組織纖維化、慢性炎癥

4、和組織破壞等，是調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、浸潤(rùn)、炎癥和血管生成的關(guān)鍵信號(hào)之一，同時(shí)在精細(xì)調(diào)控子宮內(nèi)膜的周期性脫落和修復(fù)中也發(fā)揮作用。MMP-9減少后，蛋白水解酶活性降低，破壞了纖維蛋白溶解和合成的平衡，可引起細(xì)胞外基質(zhì)在子宮內(nèi)膜中過(guò)量沉積，子宮內(nèi)膜被結(jié)締組織替代，子宮內(nèi)膜纖維化，導(dǎo)致富腔粘連的發(fā)生。
　　目的：
　　本研究的目的是應(yīng)用免疫組織化學(xué)二步法技術(shù)通過(guò)研究正常子宮內(nèi)膜組織、粘連組織旁子宮內(nèi)膜組織及粘連組織中的雌激素受體(

5、ER)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)水平，分析ER及MMP-9在各組織中的表達(dá)及相關(guān)性，試圖在分子生物學(xué)角度尋找宮腔粘連的發(fā)生機(jī)制，并為宮腔粘連的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、標(biāo)本的收集
　　觀察組:收集2011年6月至2014年6月在我院婦科住院行宮腔鏡手術(shù)，術(shù)后診斷為中度宮腔粘連的患者30例，分別取其宮腔粘連組織及粘連組織周圍正常子宮內(nèi)膜組織。對(duì)照組選擇同期因不孕癥在我院住院行宮腔鏡手術(shù)，術(shù)

6、中宮腔鏡檢查未發(fā)現(xiàn)異常的患者30例，征得患者知情同意后取其少許正常子宮內(nèi)膜組織。兩組患者的年齡及孕產(chǎn)次均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中為了減少不同等級(jí)粘連組織間的差異性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響，我們選取中度宮腔粘連組織作為研究對(duì)象，為減少不同月經(jīng)時(shí)期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，所有患者除閉經(jīng)患者外手術(shù)均選擇在月經(jīng)干凈第3～7天進(jìn)行，術(shù)后病理結(jié)果回報(bào)為增殖期子宮內(nèi)膜。
　　2、手術(shù)方法
　　所有患者除閉經(jīng)患者外均于月經(jīng)干凈后3～7

7、天進(jìn)行手術(shù)，手術(shù)日前晚及手術(shù)日清晨分別予碘伏液沖洗陰道，并予200μg米索前列醇放置陰道后穹窿軟化宮頸。采用奧林巴斯的被動(dòng)式宮腔鏡，所有的內(nèi)鏡器械均經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌處理，予5％葡萄糖液作為膨?qū)m液。麻醉選擇靜脈全麻及腰硬聯(lián)合復(fù)合麻醉，常規(guī)手術(shù)消毒后予探針探查宮腔，宮頸擴(kuò)張器逐步擴(kuò)至9號(hào)半，緩慢將宮腔鏡鏡頭插入宮腔，手術(shù)醫(yī)生評(píng)估粘連程度后逐步分離粘連組織，使宮腔恢復(fù)大致形態(tài)，微型鉗取出宮腔粘連組織及粘連組織周圍正常組織，正常對(duì)照組以微型鉗取少

8、許正常子宮內(nèi)膜組織，取出標(biāo)本立即予10％福爾馬林溶液固定。
　　3、免疫組化
　　獲取的30例正常子宮內(nèi)膜，30例宮腔粘連組織及30例粘連組織周圍的子宮內(nèi)膜組織的石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片。石蠟切片二甲苯脫臘，梯度酒精脫水(100％，90％，80％，70％)，用PH7.4的PBS溶液沖洗后，切片浸入檸檬酸緩沖液中，加熱沸騰后進(jìn)行抗原修復(fù)。加入一抗（ER為上海基因科技有限公司，MMP-9為福州邁新生物科技有限公司）兔/鼠抗人雌激素受體

9、、鼠抗人MMPs-9單克隆抗體，室溫孵育60min; PBS沖洗后加入二抗（上海基因科技有限公司）室溫孵育60min。隨后再次PBS沖洗，DAB顯色，室溫孵育3～5min，光鏡下控制顯色，蘇木精復(fù)染1分鐘，1％酒精分化，蒸餾水沖洗返藍(lán)5分鐘，切片浸入梯度酒精(70％、80％、90％、95％、100％)脫水各2分鐘，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明后用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察染色效果。
　　4、結(jié)果判斷
　　(1)宮腔粘連判斷標(biāo)準(zhǔn)

10、>　　輕度:粘連菲薄，粘連累及宮腔小于1/4，宮底和輸卵管病變輕為輕度;
　　中度:粘連形成，粘連累及宮腔小于3/4，宮底部分閉鎖，無(wú)宮壁粘著，輸卵管開(kāi)口和宮腔上端部分閉鎖為中度;
　　重度:宮壁粘著，粘連累及宮大于3/4，宮腔閉鎖，粘連帶肥厚，輸卵管開(kāi)口和宮腔上端閉鎖為重度。
　　(2)免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
　　在顯微鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算100個(gè)細(xì)胞/視野。結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及陽(yáng)性細(xì)胞

11、染色強(qiáng)度判定。結(jié)果判定:陰性（-，無(wú)染色），弱陽(yáng)性（+，淺黃色細(xì)胞＜50％或棕黃色細(xì)胞＜20％），中度陽(yáng)性(++，淺黃色細(xì)胞≥50％、20％≤棕黃色細(xì)胞＜60％或深褐色細(xì)胞＜30％），強(qiáng)陽(yáng)性(+++，棕黃色細(xì)胞≥60％或深褐色細(xì)胞≥30％)。
　　5、統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。年齡、孕次比較用單向方差分析，組間ER及MMP-9比較用卡方檢驗(yàn)，ER及MMP-9在各組織中的相關(guān)性采用S

12、pearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05（雙側(cè)檢驗(yàn)）表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、ER在所有組織中均有表達(dá)，在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)以強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為主，在宮腔粘連患者粘連組織旁的子宮內(nèi)膜中的表達(dá)以中度陽(yáng)性(++)為主，在粘連組織中的表達(dá)以陽(yáng)性(+)為主。MMP-9在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)陽(yáng)性率最高，其中以中度陽(yáng)性(+)及強(qiáng)陽(yáng)性(++)為主，在宮腔粘連患者粘連組織旁的子宮內(nèi)膜中的表達(dá)以中度陽(yáng)性(+)為主

13、，在粘連組織中的表達(dá)以陰性（-）及陽(yáng)性(+)為主。ER及MMP-9在各組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、ER的表達(dá)
　　(1) ER在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于粘連組織旁子宮內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2) ER在粘連組織旁子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于粘連組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、MMP-9的表達(dá)
　　(1)MMP-9在正常子宮內(nèi)膜組織中的表

14、達(dá)高于粘連組織旁子宮內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)MMP-9在粘連組織旁子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于粘連組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、ER與MMP-9的關(guān)系
　　(1)ER在正常子宮內(nèi)膜和粘連組織周圍子宮內(nèi)膜組織中具有直線相關(guān)性，且呈正相關(guān)(r=0.436; p=0.016＜0.05=)。
　　(2)MMP-9在正常子宮內(nèi)膜和粘連組織周圍子宮內(nèi)膜組織中具有直線相關(guān)性，且呈

15、正相關(guān)(r=0.498;p=0.005＜0.05)。
　　(3)粘連組織中ER及MMP-9不具有直線相關(guān)性(p＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、ER在粘連組織旁子宮內(nèi)膜組織及粘連組織中均呈低表達(dá)，且在粘連組織中的表達(dá)較粘連組織旁子宮內(nèi)膜中表達(dá)更低，提示ER的低表達(dá)可能促進(jìn)宮腔粘連的形成和發(fā)展。
　　2、MMP-9在粘連組織旁子宮內(nèi)膜組織及粘連組織中均呈低表達(dá)，且在粘連組織中的表達(dá)較粘連組織旁子宮內(nèi)膜中表達(dá)更低，