端粒酶及VEGF-A與宮頸癌浸潤的分子機制研究.pdf

1、子宮頸癌(Cervical cancer)是女性生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例約為50萬，80％以上在發(fā)展中國家，已成為發(fā)展中國家女性的主要致死性疾病。臨床上尚無子宮頸癌高效特異、預(yù)后良好的治療手段。特別是子宮頸癌組織浸潤、遠處轉(zhuǎn)移等問題嚴(yán)重阻礙了患者的手術(shù)治療，也是后期患者腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后差的主要原因，嚴(yán)重地降低了患者的存活率。因此，深入研究子宮頸癌浸潤、轉(zhuǎn)移的高危因素，探索宮頸癌細胞侵潤的分子機制，將有助于子宮頸癌特效

2、治療手段的研發(fā)。現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)，部分生物學(xué)因素與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。HPV感染與宮頸癌的發(fā)病率存在很強的關(guān)聯(lián)性，但不是所有病毒感染人群都會進展為宮頸癌，提示其他因素也能影響宮頸病變的發(fā)展進程。人端粒酶是現(xiàn)階段臨床實驗室檢測腫瘤常用的腫瘤標(biāo)志物；其由三個部分組成，分別是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)、人端粒酶RNA組分(hTERC)和端粒酶協(xié)同蛋白(hTpl)；已經(jīng)發(fā)現(xiàn)端粒酶hTERT mRNA的激活與宮頸癌病變的嚴(yán)重程度有明顯相關(guān)性

3、。同時，HPV持續(xù)感染引起人體組織的慢性炎癥，分泌種類繁多、作用各異的炎癥因子，包括但不限于COX-2、PGE2、IL-1、MMPs、VEGF，這些炎癥因子會促使正常細胞的變性，最終可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。但這些生物學(xué)因素與宮頸癌浸潤、轉(zhuǎn)移是否有關(guān)尚未明確?；诖?，本研究首先從子宮頸癌關(guān)系密切的臨床高危因素出發(fā)，使用相關(guān)性分析探索與細胞浸潤密切相關(guān)的生物學(xué)因素，包括HPV病毒、端粒酶以及炎癥因子等，試圖從大體上明確影響宮頸癌浸潤的高危因素；

4、然后，進一步使用分子生物學(xué)手段確定這些相關(guān)因素與宮頸癌浸潤之間的相互作用關(guān)系；最終明確導(dǎo)致宮頸癌浸潤、轉(zhuǎn)移的生物學(xué)因素，加深對宮頸癌發(fā)生發(fā)展機制的理解，為子宮頸癌特效治療手段的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究分為三個部分：
　　第一部分：子宮頸癌浸潤與HPV感染、端粒酶、炎癥因子等相關(guān)高風(fēng)險因素的相關(guān)性分析。
　　目的：探索與子宮頸癌浸潤密切相關(guān)的生物學(xué)因素。
　　方法：收集正常宮頸組織(NCE)20例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變II以上

5、(CIN II或III)20例及宮頸鱗癌組織(SCC)20例。PCR法檢測上述各種組織中HPV的感染情況；TRAP-PCR法檢測組織中端粒酶活性水平；ELISA法檢測宮頸鱗癌和正常宮頸組織中炎癥因子（VEGF-A、IL-6、MMP-9、TNF-α、BCL-2及IL-1β）的表達情況。實驗結(jié)果及其他臨床高危因素分別與宮頸癌發(fā)展浸潤程度進行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：CIN和SCC組織均為高危HPV(HPV-16和18)陽性，部分正常組織

6、也為高危HPV陽性。端粒酶活性及hTERT mRNA在宮頸癌、CINⅡ以上病變中明顯異常擴增，但是在正常宮頸組織中幾乎不出現(xiàn)異常擴增；且hTERT mRNA異常表達水平與宮頸病變的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)（p<0.0001）。
　　結(jié)論：在六個代表性的炎癥因子中，VEGF-A及其mRNA表達水平與宮頸病變程度正相關(guān)（p<0.001）。而且VEGF-A與端粒酶水平見存在正相關(guān)。
　　第二部分：VEGF對子宮頸癌Hela細胞株的細胞

7、動力學(xué)的影響。
　　目的：研究VEGF-A對子宮頸癌Hela細胞株的細胞動力學(xué)的影響。
　　方法：選取體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細胞株，依據(jù)RNAi原理，獲得針對VEGF-A基因的siRNA，并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的Hela細胞。觀察其能否特異、高效的抑制細胞中VEGF-A基因及蛋白的表達，及其對Hela細胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果：利用siRNA技術(shù)成功的抑制了Hela細胞株中VEGF-A基因及蛋白的表達，同時Hela細胞在生

8、長、增殖能力有明顯的抑制。
　　結(jié)論：VEGF-A參與了宮頸癌Hela細胞株的生長增殖。
　　第三部分：端粒酶對宮頸癌hela細胞VEGF-A分泌的影響及其機制研究。
　　目的：通過體外實驗研究端粒酶hTERT與VEGF在人乳頭狀瘤病毒陽性宮頸癌細胞的關(guān)聯(lián)性，了解宮頸癌侵潤發(fā)展的潛在分子機制。
　　方法：分別采用qRT-PCR、ELISA和TRAP-ELISA檢測多種宮頸癌細胞系端粒酶和端粒酶hTERT（端粒酶的

9、限速基因），VEGF mRNA和其蛋白的表達水平。為了探尋端粒酶對宮頸癌細胞VEGF-A分泌的作用，分別構(gòu)建hTERT shRNA質(zhì)粒和過表達質(zhì)粒用于HeLa細胞端粒酶的抑制和過表達實驗。同時研究HPV E6和E7在端粒酶影響VEGF表達中的作用。
　　結(jié)果：Hela細胞的端粒酶和VEGF表達水平都很高，且兩者間存在正相關(guān)，可用于后續(xù)實驗。抑制hTERT表達下調(diào)Hela細胞VEGF的表達，而hTERT的過表達則上調(diào)HPV-18陽性