VEGF-C與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制及逆轉(zhuǎn)策略研究.pdf

1、宮頸癌是女性第二位常見惡性腫瘤，早期就可經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而近年來，宮頸癌發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，研究表明，VEGF-C在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。本研究擬采用免疫組化和基因轉(zhuǎn)染及基因沉默技術(shù)，探討該因子在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，為將來臨床基礎(chǔ)研究和治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分VEGF-C、MMP9及TIMP-1在子宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-C)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9及其抑制物TIMP

2、-1在宮頸癌組織中的表達(dá)，及其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接染色法(SP法)，檢測(cè)62例宮頸癌Ⅰ期、Ⅱ期患者癌組織中VEGF-C、MMP9及其抑制物TIMP-1的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果VEGF-C、MMP9及其抑制物TIMP-1在宮頸鱗癌Ⅰ期、Ⅱ期均為高表達(dá)。VEGF-C在宮頸癌Ⅰ期、Ⅱ期和有淋巴轉(zhuǎn)移者的表達(dá)率分別為73.8％、85％、100％。MMP9為66.7％、75％、93.3

3、％。TIMP-1為64.3％、60％、66.7％，VEGF-C、MMP9及TIMP-1在浸潤(rùn)間質(zhì)≥1/2的表達(dá)高于＜1/2(P＜0.05)者；其表達(dá)與浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)論VEGF-C與宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；MMP9及其抑制物TIMP-1與腫瘤的浸潤(rùn)及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，VEGF-C、MMP9及TIMP-1在宮頸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。 第二部分VEGF-C基因轉(zhuǎn)染在宮頸癌HeLa中的表達(dá)及其對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究目的

4、探討脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF-C基因轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞及對(duì)其侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究。方法用RT-PCR法構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/YEGF-C重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，并加壓篩選獲得轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，經(jīng)半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VEGF-C表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中VEGF-C的表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞檢測(cè)NF-κB、bcl-2、MMP2、MMP9、TIMP-1基因的表達(dá)水平及對(duì)順鉑敏感性的變化

5、。Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移力；黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞黏附力的變化。結(jié)果1通過測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組載體pcDNA3.1(+)/VEGF-C；2轉(zhuǎn)染組VEGF-C明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組，ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染組(678.73±38.92ng/ml)，也明顯高于空載體組(129.52±50.73ng/ml)，和未轉(zhuǎn)染組(123.05±55.83ng/ml)，成功構(gòu)建了高表達(dá)VEGF-C的宮頸癌細(xì)胞株HeLa/S1

6、；3在HeLa/S1組NF-κB的表達(dá)(2.06±0.09vs1.35±0.02vs1.38±0.02P＜0.05)、bcl-2的表達(dá)(2.02±0.67vs0.41±0.06vs0.37±0.06P＜0.05)明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組；4在宮頸癌細(xì)胞株HeLa/S1中MMP2的表達(dá)(2.41±0.81vs0.48±0.09vs0.49±0.18P＜0.05)、MMP9的表達(dá)(2.26±0.29vs0.93±0.24vs0.79±0.

7、05P＜0.05)明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組；TIMP-1(0.54±0.03vs1.01±0.06vs1.03±0.06P＜0.05)的表達(dá)低于空載體和未轉(zhuǎn)染組，在HeLa/S1細(xì)胞中MMP9/TIMP-1比值4.7；5在宮頸癌HeLa/S1細(xì)胞株中可檢測(cè)到其對(duì)順鉑有弱的耐藥性(1.84倍)；6在體外實(shí)驗(yàn)侵襲轉(zhuǎn)移和黏附實(shí)驗(yàn)中，HeLa/S1細(xì)胞較空載體組和未轉(zhuǎn)染組具有較大的侵襲轉(zhuǎn)移力及黏附能力。結(jié)論脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF-C基因轉(zhuǎn)染人宮頸

8、癌HeLa可顯著增加VEGF-C表達(dá)，高表達(dá)的VEGF-C可激活NF-κB,使抗凋亡基因bcl-2高表達(dá)；同時(shí)引起MMP2、9高表達(dá)，TIMP-1低表達(dá)；從而使轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有較大的侵襲和轉(zhuǎn)移力。 第三部分siRNA沉默VEGF-C基因?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞的生物學(xué)特性影響目的通過RNA干擾技術(shù)抑制宮頸癌細(xì)胞VEGF-C表達(dá)，探討干擾后VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化。方法根據(jù)人VEGF-Cm

9、RNA編碼序列，設(shè)計(jì)RNA干擾的靶點(diǎn)，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，通過RT-PCR法觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的變化，用MTT法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染siRNA24h、48h可以使HeLa細(xì)胞VEGF-CmRNA含量分別降低，在24h降低80.63±0.24％(P＜0.001)； 在48h降低38.9±0.85％(P＜0.01)；NF-κBmRNA含量也分別降低，在24

10、h降低37.55±2.76％(P＜0.05)；在48h降低30.5±3.82％(P=0.056)；bcl-2mRNA含量同時(shí)分別降低，在24h降低76.95±1.91％，(P＜0.01)；在48h降低64.11±2.96％，(P＜0.05))；干擾后HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50約降低40倍。結(jié)論脂質(zhì)體介導(dǎo)的VEGF-CsiRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，可以有效抑制VEGF-C的表達(dá)；可能通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，抑制抗凋亡基因bcl-2的