一種哺乳動物性腺特異表達基因的克隆及組織細胞定位的初步研究.pdf

1、本論文旨在研究一種哺乳動物性腺特異表達基因—GSE(Gonad-Specific Expression Gene，GSE)和其在睪丸組織中的定位。論文共分為兩部分：第一部分為文獻綜述部分；第二部分包括第二章和第三章，為試驗研究部分。 第二章的研究目的是通過對廣西本地水牛GSE基因及3'端序列進行克隆和分析，為進一步研究水牛GSE基因的功能打下基礎(chǔ)。根據(jù)小鼠GSE基因以及GeneBank中與小鼠GSE基因相似的其它哺乳動物的相似基

2、因進行分析，設(shè)計一對擴增水牛GSE基因保守區(qū)序列的引物。然后以成年水牛睪丸總RNA為模板，通過RT-PCR的方法擴增出長度為396 bp的水牛GSE基因保守區(qū)序列。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，連接至pMD18-T載體上進行測序。結(jié)果顯示，該片段與小鼠GSE基因的覆蓋區(qū)同源性為76％。再根據(jù)所得到的這段已知序列設(shè)計一條上游引物，通過3'RACE的方法擴增水牛GSE基因的3’端序列，結(jié)果得到42-bp的3’非編碼區(qū)。將該片段與先前擴增得到的序列拼接后

3、得到了一段長度為700 bp的片段，這也是目前得到的水牛GSE基因的最長片段。應用Scansite蛋白質(zhì)磷酸化預測軟件對得到的水牛GSE蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，水牛GSE基因所編碼的多肽鏈中含有一個具有SH2結(jié)構(gòu)域的Shc蛋白的結(jié)構(gòu)(VKLSPGQYELLPPPV)，同時還含有一個蛋SH2結(jié)構(gòu)域的Shc蛋白的結(jié)構(gòu)(VKLSPGQYELLPPPV)，同時還含有一個蛋白激酶C的μ亞型(PKC-μ)結(jié)構(gòu)(PPPVPKQASRSFVFRSTVQRFP

4、)。這些結(jié)構(gòu)說明，GSE蛋白很可能在磷酸化和去磷酸化方面具有生物活性。 第三章的研究目的是通過組織原位雜交的方法，確定水牛GSE基因在睪丸中確切的表達部位，從而進一步了解該基因在配子發(fā)生中的作用。用擴增得到的水牛GSE基因序列作為模板，制備用于組織原位雜交的地高辛標記的cDNA探針，并經(jīng)過效率檢測和斑點雜交檢測后確定可用于組織原位雜交。最后，將制備好cDNA探針與成年水牛睪丸石蠟切片進行組織原位雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成年水牛睪丸曲細