外源mmu-miR-505在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的：miRNA是一類長(zhǎng)約22 nt具有調(diào)節(jié)功能的保守的非編碼小RNA，在調(diào)控發(fā)育時(shí)序，細(xì)胞增殖與凋亡以及腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。同時(shí) miRNA也參與了神經(jīng)細(xì)胞的自我更新、脊椎動(dòng)物的發(fā)育、心臟、肌肉以及神經(jīng)系統(tǒng)的形成等多種生物學(xué)過程和信號(hào)通路。哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有多種生物學(xué)功能，與蛋白質(zhì)合成、免疫、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及代謝、細(xì)胞凋

2、亡及自噬等均有聯(lián)系。通過查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn) miRNA-505也許通過影響 ASF/SF2的表達(dá)，而參與調(diào)控 mTOR通路。為了進(jìn)一步研究 miRNA-505的生物學(xué)功能，我們分別利用質(zhì)粒 pcDNA6.2、慢病毒載體 FUGW及 Fsy，構(gòu)建了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá) miRNA-505-3p，-5p的載體，它們分別受到病毒來(lái)源啟動(dòng)子 CMV（巨細(xì)胞病毒）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性啟動(dòng)子UBC（泛素酶）及神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子 Syn（突觸蛋白I）調(diào)

3、控，以獲得具有不同表達(dá)效率及組織特異性的載體。脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞與 HEK293T等細(xì)胞系中，檢測(cè)細(xì)胞中 miRNA-505的表達(dá)量與相關(guān)蛋白 ASF/SF2的變化。
　　方法：將miR-505-3p與miR-505-5p成熟體分別構(gòu)建成shRNA形式，裝入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表達(dá)載體中，采用PCR方法從pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-505-3p，5p表達(dá)載體質(zhì)粒擴(kuò)增出

4、miR-505-3p/5p shRNA基因編碼區(qū)173bp、175bp片段，通過限制性酶切、T4 DNA連接酶連接，分別將miR-505-3p，5p shRNA基因插入慢病毒表達(dá)載體 FUGW與 Fsy中，構(gòu)建成重組載體FUGW-miR-505-3p/5p與Fsy-miR-505-3p/5p。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將構(gòu)建成功的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞和HEK293T等細(xì)胞系，熒光顯微鏡下觀測(cè)EGFP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率，R

5、T-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中miR-505的表達(dá)量。western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白ASF/SF2的變化。
　　結(jié)果：1、成功構(gòu)建帶有miRNA-505 shRNA基因片段的四種慢病毒載體FUGW-miR-505-3p，F(xiàn)UGW-miR-505-5p，F(xiàn)sy-miR-505-3p和Fsy-miR-505-5p。
　　2、熒光顯微鏡下觀察到，慢病毒載體Fsy-miR-505轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中EGFP熒光強(qiáng)度較高

6、；HEK293T細(xì)胞系中，重組質(zhì)?？傮w轉(zhuǎn)染效率較高，F(xiàn)UGW-miR-505轉(zhuǎn)染的細(xì)胞EGFP熒光強(qiáng)度最高，F(xiàn)sy-miR-505轉(zhuǎn)染的細(xì)胞EGFP熒光強(qiáng)度最弱。
　　3、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 pcDNA-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p與Fsy-miR-505-3p的細(xì)胞中miR-505-3p增多;轉(zhuǎn)染pcDNA-miR-505-5p、FUGW-miR-505-5p與Fsy-miR-505-5p

7、的細(xì)胞中miR-505-5p明顯增多。
　　4、Western blot結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-505-3p表達(dá)質(zhì)粒和ASF/SF2表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中ASF/SF2蛋白降低。
　　結(jié)論：結(jié)果表明Fsy-miR-505-3p/5p在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞中特異性表達(dá)，而在 HEK293T等細(xì)胞系中表達(dá)比其他兩種質(zhì)粒FUGW-miR-505-3p/5p、pcDNA-miR-505-3p/5p低；Western blot結(jié)果表明在He