S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因工程菌的構建及活性分析.pdf

1、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)在真核細胞中具有重要的甲基循環(huán)代謝調節(jié)作用，是存在于生物細胞內調節(jié)甲基反應的一種水解酶，此水解酶廣泛存在于真核細胞如：人類、植物、真菌中。SAHH其主要的功能是催化S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解生成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷(Ado)的可逆反應。研究表明人體內 S-腺苷高半胱氨酸水解酶水平的高低可能影響冠心病和阿爾茨海默癥即老年癡呆病的發(fā)病概率。
　　為了更好的研究該酶，我們通過基因克隆技術將

2、人源表達SAHH的基因整合到畢赤酵母菌基因組上，成功構建真核表達體系，再利用畢赤酵母菌表達該目的蛋白SAHH。具體的實驗方案如下：首先，我們從 GenBank中查找到編碼人源的S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，在此目的基因前后設計酶切位點和重組標簽 His-tag。通過全基因合成技術合成擁有完整編碼框的 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因，構建pPIC9K-sahh表達載體。然后，利用同尾酶 Bgl II酶切克隆載體，通過電轉化使其整合到畢赤酵母

3、菌 GS115的基因組中，用遺傳霉素 G418篩選出高拷貝轉化子，轉化子通過 MD和 MM平板鑒定其表型為 MutS型。經菌體 PCR驗證后，將篩選到的陽性轉化子用1％甲醇誘導，使其分泌 SAHH蛋白，之后我們利用冷凍干燥器將產物濃縮，利用0.22μm的濾膜過濾雜質和晶體。最后，我們將濃縮后的液體通過 Ni-NTA親和層析對重組 SAHH蛋白進行純化。此方法具有篩選方便、蛋白產物分泌表達穩(wěn)定和易于純化等優(yōu)點。人源 sahh基因包含129

4、9個堿基對，其編碼432個氨基酸，因此理論上此水解酶的相對分子量約為47.5 kDa，通過 SDS-PAGE得出發(fā)酵產物的條帶大小約為48 kDa。由于SAH被 SAHH一步水解為高半胱氨酸和腺苷，而高半胱氨酸可直接用 Ellman試劑直接定量測定，在412 nm下吸光度隨著產物的升高而升高，我們測得濃縮后的 SAHH蛋白酶活為626.6 IU，而經過 Ni-NTA親和層析純化后的 SAHH蛋白酶活為1106.8 IU。而對照組即 sa

5、hh基因沒有整合到畢赤酵母菌 GS115基因組上的菌體通過此方法發(fā)酵得到的產物，測其酶活性約為1.33 IU，因此對于畢赤酵母菌 GS115本身的發(fā)酵產物對本實驗的研究結果可以忽略不計。同時我們通過查閱文獻獲知有些研究通過對表達體系的表達條件進行優(yōu)化后酶活可達到1600 IU相比我們所得的酶活較高，但是我相信我們在之后的對表達體系的表達條件進行優(yōu)化后一定比1600 IU高。
　　結論：此研究中我們成功構建畢赤酵母菌真核表達體系，同