大腸桿菌S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的功能性研究及其藥物虛擬篩選.pdf

1、目前，在感染病領域由耐藥細菌引起的疾病感染是全球正在關注的熱點。對藥物的作用靶點結構進行修飾可以通過甲基化過程來實現(xiàn)，這是致病菌一種重要的耐藥機制。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在細胞中是一種通用的甲基供體，在甲基循環(huán)中起著非常重要的作用，如果某些關鍵的蛋白質與SAM的生化代謝途徑相關，那么此蛋白質有可能成為一種藥物靶點。在甲基轉移酶催化作用下，S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由甲基供體SAM參與去甲基化反應生成。SAH在轉甲基化反應過程是一種

2、有效的競爭性抑制劑，對細胞內的核酸和蛋白質有強烈的毒性，能抑制它們的修飾過程。在哺乳動物細胞內，SAH在S-腺苷高半胱氨酸水解酶（SAHH）作用下發(fā)生水解反應，只需要一步就生成產(chǎn)物高半胱氨酸和腺苷酸，而在大多數(shù)病原微生物的細胞內沒有表達SAHH蛋白的能力，SAH只能是在S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)兩種酶的參與下發(fā)生催化分解反應，生成腺嘌呤和高半胱氨酸。另外，經(jīng)甲基修飾的供體SAM發(fā)生甲基化反應

3、后除生成SAH還能生成甲硫腺苷(MTA)。在很多致病性的病原微生物中，MTA在S-腺苷高半胱氨酸/甲硫腺苷核苷酶（SAHN）作用下發(fā)生分解反應，生成腺嘌呤和5'-甲硫核糖(MTR)，MTR立即進入下一步反應，在5'-甲硫核糖激酶（MTR Kinase）作用下發(fā)生磷酸化反應，生成的產(chǎn)物是5'-甲硫核糖-1-磷酸(MTRP)。但是，在致病菌的宿主哺乳類等真核細胞內，MTA是通過不同的途徑來進行反應的，在5'-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)催化

4、作用下生成MTRP和腺嘌呤。病原微生物和宿主細胞在是SAH代謝節(jié)點和MTA代謝節(jié)點的不同，使得在致病菌中特有的能分解SAH和MTA反應的SAHN核苷酶成為抗感染藥物的一個具有潛力的分子靶標。
　　本論文利用Red/ET同源重組法敲除大腸桿菌MG1655的sahn基因，通過同源重組雙交換的方法用卡那霉素抗性基因取代基因組中整個sahn基因的編碼序列。轉入重組酶表達質粒以消除抗性篩選標記，得到保留單—LoxP位點的突變菌株△sahn。

5、同時，本論文成功構建重組表達載體pET-28a-sahn。以IPTG作為誘導劑進行誘導表達，并通過Ni-NTA親和層析對SAHN酶蛋白進行純化。用考馬斯亮藍法測定經(jīng)除鹽濃縮后的蛋白含量約為368μg/mL，根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法計算SAHN酶蛋白的酶促反應動力學參數(shù)Vmax和Km實驗研究還發(fā)現(xiàn)SAHN酶蛋白在不同的表達水平下，群感效應的表征信號分子AI-2和菌膜的形成均有所差異。最后，采用分子對接技術從小分子數(shù)據(jù)庫中篩選到一種新型抑制劑，