D-苯丙氨酸基因工程菌的初步構(gòu)建.pdf

1、D-苯丙氨酸是L-苯丙氨酸的手性對(duì)映體，與L-苯丙氨酸理化性質(zhì)近似，僅旋光性相反，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，D-苯丙氨酸屬于非蛋白型氨基酸，很難從天然產(chǎn)物中大量獲得。其目前的主要生產(chǎn)方法為化學(xué)合成法，成本很高，無(wú)法滿足D-苯丙氨酸逐漸升高的市場(chǎng)需求。因此，發(fā)展新的廉價(jià)的生產(chǎn)D-苯丙氨酸乃至D-氨基酸方法是目前國(guó)際上氨基酸領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。直接發(fā)酵法是L-苯丙氨酸的主要生產(chǎn)方法，其效率高、低成本、工藝流程簡(jiǎn)單。但目前國(guó)內(nèi)外仍無(wú)法

2、實(shí)現(xiàn)D-苯丙氨酸的直接發(fā)酵法生產(chǎn)，其最主要原因就是沒(méi)有性能良好的的D-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株。
　　 本文以野生型大腸桿菌W3110為出發(fā)菌株，以構(gòu)建D-苯丙氨酸基因工程菌株為目標(biāo)，對(duì)大腸桿菌L-苯丙氨酸合成與分解代謝進(jìn)行系統(tǒng)的研究和改造，并且構(gòu)建了其本身不存在的D-苯丙氨酸合成模塊。通過(guò)無(wú)痕敲除等基因工程手段，初步構(gòu)建了D-苯丙氨酸基因工程菌株。
　　 首先對(duì)大腸桿菌中存在的苯丙氨酸合成途徑進(jìn)行改造，通過(guò)敲除鄰氨基苯甲酸合酶

3、基因(trpE)、分支酸變位酶基因(tyrA)，阻斷合成色氨酸、酪氨酸的合成支路；解除關(guān)鍵酶分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶基因(pheA)的反饋抑制，構(gòu)建pheAfor基因和另一限速酶DAHP合酶基因aroF的表達(dá)質(zhì)粒，獲得了基因工程菌株EC237。我們通過(guò)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證EC237具有積累L-苯丙氨酸的能力，同時(shí)也表明上述基因工程改造可以有效的擴(kuò)大L-苯丙氨酸的合成通路的代謝流；在EC237的基礎(chǔ)上，引入了來(lái)源于枯草芽胞桿菌W168的D-氨基

4、轉(zhuǎn)移酶，構(gòu)建了D-苯丙氨酸生物合成途徑，通過(guò)敲除L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(aspC,tyrB)使苯丙酮酸得到有效積累，通過(guò)敲除D-苯丙氨酸分解酶的基因(dadA)阻斷D-苯丙氨酸的分解，最終構(gòu)建了D-苯丙氨酸的初級(jí)基因工程菌EC238。經(jīng)過(guò)48h的搖瓶發(fā)酵菌株EC238有2.35mmol/L的苯丙氨酸積累；在7.5L發(fā)酵罐上發(fā)酵48h，菌株有6mmol/L的苯丙氨酸積累，菌株的產(chǎn)酸能力與搖瓶發(fā)酵相比提高2.55倍，其中有0.5mmol/L