S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)的基因功能分析.pdf

1、通用甲基供體SAM受甲基轉(zhuǎn)移酶催化去甲基后，生成的通用產(chǎn)物是S-腺苷高半胱氨酸。真核生物通過S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)水解S-腺苷高半胱氨酸一步反應(yīng)生成高半胱氨酸，而在大多數(shù)的原核生物細胞內(nèi)則不表達SAHH蛋白，SAH是通過SAHN和LuxS兩步酶催化反應(yīng)才生成高半胱氨酸。此外，甲基化修飾的通用甲基供體SAM在多胺合成酶、N-?；呓z氨酸內(nèi)酯合成酶的作用下除生成多胺及N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯外均生成甲基硫腺苷(MTA)。MTA在大

2、部分病原微生物等原核細胞內(nèi)被甲基硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)裂解為腺嘌呤和5'-甲硫核糖(MTR)，MTR隨即被5'-甲硫核糖激酶磷酸化生成5'-甲硫核糖-1-磷酸(MTRP)。而在作為致病菌宿主的哺乳動物等真核生物細胞內(nèi)，MTA則是由專一性5'-甲硫腺苷磷酸化酶催化一步反應(yīng)生成MTRP和腺嘌呤。隨后MTRP經(jīng)多步反應(yīng)生成甲硫氨酸(Met)，Met在SAM合成酶的作用下又重新生成SAM，從而完成整個AMC甲基循環(huán)(Act

3、ivated Methyl Cycle)。病原微生物和宿主細胞在S-腺苷高半胱氨酸代謝節(jié)點和AMC甲基循環(huán)中MTA節(jié)點的顯著差異，使病原微生物催化MTA和SAH裂解的SAHN核苷酶成為抗感染藥物的潛在靶點。
　　本實驗以大腸桿菌基因組DNA為模板，通過PCR擴增目的基因sahn，構(gòu)建pET-28a-SAHN重組表達載體，轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達獲得SAHN蛋白，并利用Ni-NTA親和層析對帶有重組標簽

4、His-tag的SAHN蛋白進行純化。之后利用Pall超濾管除鹽濃縮，對其進行SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮藍法濃度測定，最終得到了比較純的并且達到相當濃度量的sahn基因表達蛋白。同時本實驗成功構(gòu)建了重組LuxS蛋白工程菌，最終通過哈氏弧菌（V.harveyi）BB170發(fā)光菌株測得的重組luxS基因能夠成功表達出有一定活性的LuxS蛋白?；谥亟MSAHN蛋白和LuxS蛋白的成功表達，下一步我們將建立基于甲基轉(zhuǎn)移酶的酶偶聯(lián)分析檢測

5、技術(shù)。
　　MTA能被SAHN酶裂解為5'-甲硫核糖（Methylthioribose，MTR）和腺嘌呤(Adenine)，腺嘌呤通過偶聯(lián)的黃嘌呤氧化酶(XOD)催化生成在300 nm具有光吸收的二羥腺嘌呤(ε300=15.2 mM-1cm-1)。利用上述反應(yīng)過程，本實驗成功建立了基于黃嘌呤氧化酶的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)，并進一步對SAHN的酶反應(yīng)動力學參數(shù)Vmax和Km進行表征。得到37℃、pH7.0條件下，酶促反應(yīng)Vmax和Km值

6、分別為5.4885μM·min-1和105.68μM。
　　最后，本實驗利用成功建立的基于黃嘌呤氧化酶的酶偶聯(lián)分析檢測方法，對SAHN催化MTA反應(yīng)的最適溫度及pH值條件進行了探究。由實驗結(jié)果可知:酶促反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為37～42℃，在最適溫度酶促反應(yīng)最快，溫度向兩側(cè)偏移反應(yīng)變慢，高溫使酶失活所以往高溫移動曲線降到零，低溫是趨近于零;酶促反應(yīng)的最適pH為5.8～6.3，在最適pH酶促反應(yīng)最快，pH向兩側(cè)偏移反應(yīng)變慢，且偏酸性條件