DNA拓撲結(jié)構(gòu)與DNA拓撲異構(gòu)酶的研究.pdf

1、在體內(nèi),DNA是以超螺旋的形式存在的。DNA超螺旋屬于拓撲學的研究范疇,因此DNA的高級結(jié)構(gòu)也稱DNA拓撲結(jié)構(gòu),DNA拓撲學。DNA超螺旋是細胞內(nèi)很多生理活動所必須的,同時由DNA拓撲異構(gòu)酶來調(diào)節(jié)和控制DNA超螺旋密度的變化。
　　 為研究超螺旋DNA的堿變性作用,本研究中,將質(zhì)粒pBR322 DNA進行一系列NaOH濃度梯度處理。結(jié)果顯示超螺旋DNA的堿變性作用發(fā)生在一個很窄的pH范圍(12.88-12.90)。堿變性超螺旋D

2、NA在電泳中形成一條泳動速度快于超螺旋DNA的敏銳的條帶。三種不同的質(zhì)粒經(jīng)過堿變性處理后的樣品后經(jīng)原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示,與超螺旋DNA相比,堿變性超螺旋DNA有粗糙的表面,雙鏈上含有大量扭結(jié)和凸起,同時含有不均一的雙螺旋直徑。質(zhì)粒經(jīng)堿變性處理后分子周長縮短。所有證據(jù)表明,堿變性超螺旋DNA是一個穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),它的雙鏈間通過非正常配對的拓撲鍵相聯(lián)系,含有鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)。這些Ⅳ型DNA的特殊結(jié)構(gòu)賦予它特殊的物理特性。
　　 1974

3、年Delius和Worcel用電子顯微鏡觀察到大腸桿菌染色體。DNA是由許多阿基米德螺線樣螺線型超螺旋亞結(jié)構(gòu)組成的,細胞如何促成這種DNA包裝形式至今還不清楚。本研究使用原子力顯微鏡法,生物化學法證明從大腸桿菌細胞中抽提的質(zhì)粒pBR322 DNA存在著新發(fā)現(xiàn)的拓撲結(jié)構(gòu)鍵.分子內(nèi)拓撲交聯(lián)(Intramolecular topological interlink,ITL),這種拓撲鍵以分子不同部分的交叉把DNA分子分成不同的拓撲學結(jié)構(gòu)域,促

4、使cccDNA形成螺線型超螺旋分子。分子內(nèi)交聯(lián)次數(shù)不同使cccDNA分子形成分子內(nèi)交聯(lián)拓撲異構(gòu)體,它們在瓊脂糖凝膠電泳中形成梯狀區(qū)帶。而大腸桿菌旋轉(zhuǎn)酶能催化pBR322 DNA形成不定數(shù)量的單純超螺旋拓撲異構(gòu)體,在電泳中形成弧形涂抹區(qū)帶,因此分子內(nèi)拓撲交聯(lián)不屬于方程Lk=Tw+Wr的任意一個參數(shù)。由pBR322 DNA原子力圖像測定的DNA分子的ITL數(shù)與分子直徑成反比。位點特異單鏈切刻能以一種緩慢的過程松弛螺線型超螺旋DNA。由大腸桿

5、菌細胞抽提物參與的四種拓撲異構(gòu)酶對松弛型pBR322底物的酶促反應(yīng)中只有拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的酶促反應(yīng)可使質(zhì)粒DNA在電泳中形成分子內(nèi)交聯(lián)DNA拓撲異構(gòu)體梯形區(qū)帶,這事實說明拓撲異構(gòu)酶Ⅳ是在細胞內(nèi)促成交聯(lián)拓撲鍵的形成的酶,事實表明DNA分子拓撲交聯(lián)是造成DNA螺線型超螺旋的另一個拓撲結(jié)構(gòu)因子。由于螺線型超螺旋在包裝致密度和DNA可接觸性上優(yōu)于互纏式超螺旋和線圈型超螺旋,螺線型超螺旋可能是細胞內(nèi)染色體DNA普遍存在的折疊形式。
　　 原子

6、力顯微鏡(AFM)是近年來發(fā)展起來的成像DNA分子結(jié)構(gòu)的重要工具,但其應(yīng)用于DNA拓撲結(jié)構(gòu)成像時,對條件要求較高,現(xiàn)有研究缺乏對最適條件的深入分析,同時也缺乏對DNA成像質(zhì)量的客觀評價方法。本研究依據(jù)大量成像結(jié)果,設(shè)定了成像質(zhì)量評價的三個參數(shù),建立了一套反映AFM觀測DNA精細結(jié)構(gòu)成像質(zhì)量的評估體系,并依據(jù)該體系對樣品中DNA分子濃度、樣品中Mg2+濃度以及環(huán)境相對濕度三個關(guān)鍵條件進行評估得到了原子力顯微鏡觀測DNA拓撲結(jié)構(gòu)的適用條件。