東方蠑螈精子發(fā)生過(guò)程中生精細(xì)胞凋亡機(jī)制及KIFC1在精子形成中的功能.pdf

1、東方蠑螈(Chinese fire-belly newt，Cynops orientalis)是國(guó)家級(jí)珍稀保護(hù)動(dòng)物，在發(fā)育生物學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要科研價(jià)值。但是，近些年由于野外人為過(guò)度抓捕和蠑螈棲息地遭到破壞，東方蠑螈野生資源日益枯竭。東方蠑螈日益減少是否由于環(huán)境的惡化導(dǎo)致其野外生殖能力下降是我們非常關(guān)心的科學(xué)問(wèn)題，深入了解該物種精子形成過(guò)程以及精子質(zhì)量控制機(jī)制是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵。精子形成過(guò)程是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的、復(fù)雜

2、的動(dòng)態(tài)過(guò)程，精子形成過(guò)程通常有三大重要的生物學(xué)事件發(fā)生：頂體發(fā)生、細(xì)胞核形變和精子尾部形成。精子形成過(guò)程的順利進(jìn)行和高質(zhì)量精子的產(chǎn)生對(duì)于東方蠑螈的物種繁衍至關(guān)重要。本論文以東方蠑螈精子發(fā)生作為模式系統(tǒng)，從精子結(jié)構(gòu)和生精細(xì)胞凋亡模式到精子形態(tài)建成的動(dòng)力學(xué)機(jī)制等角度，對(duì)該物種功能性精子形成過(guò)程和機(jī)制進(jìn)行了比較深入的探索，旨在解決上述科學(xué)問(wèn)題。
　　 1.p53在生精細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用 p53是一個(gè)重要的癌癥抑制因子，它在DNA修復(fù)

3、、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程中普遍存在生精細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而p53在這個(gè)過(guò)程中作為重要角色發(fā)揮功能?；谝延械目茖W(xué)研究成果，我們總結(jié)了精子發(fā)生過(guò)程中p53的表達(dá)模式、外界壓力對(duì)生精細(xì)胞中p53基因和蛋白表達(dá)模式的影響、p53缺失或者表達(dá)異常對(duì)雄性生殖能力的影響以及p53參與生精細(xì)胞凋亡過(guò)程的分子機(jī)制。本綜述為更為深入了解和研究p53這一重要癌癥抑制因子在動(dòng)物精子發(fā)生過(guò)程的重要作用及其機(jī)制提供很好的參考。
　　

4、 2.東方蠑螈精子超微結(jié)構(gòu)我們利用掃描電鏡和透射電鏡方法研究了東方蠑螈成熟精子的超微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成熟精子包括頭部、頸部和尾部三個(gè)部分。精子頭部包括頂體、頂體下錐、穿孔器和細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)。頸部比頭部稍短，連接頭部和尾部。尾部主要包括中段、主段和末段，中段和主段主要由軸纖維、波動(dòng)膜、軸絲和邊緣絲等結(jié)構(gòu)組成，末段由軸絲和邊緣絲或者只有軸絲構(gòu)成。
　　 3.東方蠑螈精子發(fā)生過(guò)程中生精細(xì)胞凋亡模式以及p53、Apaf1、Caspas

5、e3和Caspase7的作用東方蠑螈作為重要兩棲類動(dòng)物是研究生精細(xì)胞凋亡機(jī)制的良好動(dòng)物模型，因?yàn)闁|方蠑螈不但對(duì)溫度敏感，對(duì)饑餓有超強(qiáng)的忍耐力，而且因其皮膚很薄對(duì)水環(huán)境重金屬污染非常敏感，而溫度、饑餓、重金屬等是研究生精細(xì)胞凋亡常用的手段。本研究中，我們利用基因克隆、Realtime RT-PCR，TUNEL，Caspase酶活檢測(cè)等方法研究了東方蠑螈受到外界環(huán)境和內(nèi)部生理壓力后，生精細(xì)胞發(fā)生凋亡過(guò)程中p53、Apaf1、Caspase3

6、和Caspase7的作用。研究結(jié)果表明，熱休克、冷休克、重金屬暴露等誘導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡過(guò)程是通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)源性和外源性細(xì)胞凋亡通路并最終激活Caspase3實(shí)現(xiàn)的，Apaf1很可能參與了這些凋亡過(guò)程。而饑餓壓力誘導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡可能主要通過(guò)外源性細(xì)胞凋亡路徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，p53可能沒(méi)有參與到各種環(huán)境壓力和生理壓力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。東方蠑螈精子發(fā)生過(guò)程中高頻率的精細(xì)胞和成熟精子凋亡現(xiàn)象可能是由東方蠑螈精子形態(tài)特點(diǎn)以及特殊生殖策略導(dǎo)致的。
　

7、　 4.東方蠑螈精子形成過(guò)程中KIFC1和Nup62的功能探索KIFC1作為重要的驅(qū)動(dòng)蛋白在動(dòng)物精子形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。我們利用基因克隆、蛋白原核表達(dá)、抗體制作、免疫熒光和免疫電鏡等方法，研究了東方蠑螈精子形成過(guò)程中KIFC1的作用。結(jié)果表明，KIFC1和Nup62重要功能結(jié)構(gòu)域以及蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)在物種進(jìn)化過(guò)程中非常保守。東方蠑螈精子形成過(guò)程中，KIFC1可能通過(guò)運(yùn)輸高爾基體來(lái)源的膜泡物質(zhì)參與了精子頂體發(fā)生過(guò)程，并且在Nup62和微