小鼠絲氨酸-精氨酸蛋白特異激酶SRPK2在精子發(fā)生過程中的表達及作用分析.pdf

1、目的：
　　首先對前期酵母雙雜交篩選的精子發(fā)生相關(guān)基因3(Spermatogenesis associated3， spata3)相關(guān)蛋白進行生物信息學(xué)分析，繼而檢測目標(biāo)基因的組織特異性及階段特異性表達情況，從中選擇在睪丸組織大量表達并具有明顯階段特異性的基因作為本研究的具體靶標(biāo)。進一步從蛋白水平分析靶標(biāo)基因編碼蛋白的組織、細胞定位，同時，運用分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶基因的真核表達載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達Hela細胞模型，在細胞水平探討

2、該基因的潛在功能，為揭示該基因在精子發(fā)生過程中的作用和意義提供更多實驗素材。
　　方法：
　　1.通過生物信息學(xué)方法對spata3相互作用蛋白進行分析和預(yù)測；
　　2.分別采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡雜交技術(shù)(Western blotting)分析候選基因mRNA及其蛋白在小鼠多種組織中的表達；
　　3.利用實時定量PCR(real-time quantitative PCR)

3、檢測各基因mRNA在小鼠睪丸不同發(fā)育階段的差異表達；
　　4.通過 Western blotting檢測目標(biāo)基因編碼產(chǎn)物在不同周齡的小鼠睪丸中的階段差異性表達；
　　5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)觀察目標(biāo)基因編碼蛋白在小鼠曲精小管和生精細胞中的定位；
　　6.通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建目標(biāo)基因真核表達重組質(zhì)粒；
　　7.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela細胞，建立過表達模型，分別采用RT-PCR和 Western blott

4、ing檢測細胞中靶基因的表達；
　　8.利用MTT法在細胞水平檢測轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細胞的增殖狀況；流式細胞術(shù)檢測細胞周期和細胞凋亡變化。
　　結(jié)果：
　　1.利用生物信息學(xué)對酵母雙雜交篩選的spata3相關(guān)作用蛋白進行分析，推測常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸 N-甲基轉(zhuǎn)移酶2(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase2, Ehmt2)，突觸素樣蛋白(synaptophysin-li

5、ke protein, Sypl)，環(huán)指和 CHY鋅指結(jié)構(gòu)域1(ring finger and CHY finger domain containing1, Rchy1)和絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase2, SRPK2)可能在精子發(fā)生過程中與spata3有密切聯(lián)系；
　　2.半定量RT-PCR和Western blotting分析顯示SRPK2

6、和Sypl的mRNA和蛋白在小鼠睪丸中均大量表達；
　　3.實時定量PCR結(jié)果顯示SRPK2 mRNA的表達趨勢呈規(guī)律性增強，具有明顯的階段特異性表達特征；
　　4.Western blotting在蛋白水平檢測到SRPK2蛋白有明顯的階段特異性表達；
　　5.免疫組化和免疫熒光染色結(jié)果表明SRPK2蛋白主要位于長形精子細胞核表面；
　　6.雙酶切分析及DNA序列測定結(jié)果均表明真核表達質(zhì)粒p3×Flag-SRPK

7、2構(gòu)建成功；
　　7.經(jīng)RT-PCR和Western blotting檢測，SRPK2基因在轉(zhuǎn)染后的Hela細胞內(nèi)過表達；
　　8.過表達SRPK2的Hela細胞增殖率明顯高于對照組細胞(P<0.05)，使G1期明顯降低(P<0.05)，凋亡率明顯減少(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.SRPK2基因在小鼠睪丸中高表達，并具有顯著的階段特異性表達特征和明確的細胞定位，極有可能在小鼠精子發(fā)生的變態(tài)成形期參與mR