小鼠絲氨酸-精氨酸蛋白特異激酶SRPK2在精子發(fā)生過程中的表達(dá)及作用分析.pdf

1、目的：
　　首先對(duì)前期酵母雙雜交篩選的精子發(fā)生相關(guān)基因3(Spermatogenesis associated3， spata3)相關(guān)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，繼而檢測(cè)目標(biāo)基因的組織特異性及階段特異性表達(dá)情況，從中選擇在睪丸組織大量表達(dá)并具有明顯階段特異性的基因作為本研究的具體靶標(biāo)。進(jìn)一步從蛋白水平分析靶標(biāo)基因編碼蛋白的組織、細(xì)胞定位，同時(shí)，運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建靶基因的真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達(dá)Hela細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平探討

2、該基因的潛在功能，為揭示該基因在精子發(fā)生過程中的作用和意義提供更多實(shí)驗(yàn)素材。
　　方法：
　　1.通過生物信息學(xué)方法對(duì)spata3相互作用蛋白進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；
　　2.分別采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡雜交技術(shù)(Western blotting)分析候選基因mRNA及其蛋白在小鼠多種組織中的表達(dá)；
　　3.利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR)

3、檢測(cè)各基因mRNA在小鼠睪丸不同發(fā)育階段的差異表達(dá)；
　　4.通過 Western blotting檢測(cè)目標(biāo)基因編碼產(chǎn)物在不同周齡的小鼠睪丸中的階段差異性表達(dá)；
　　5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)觀察目標(biāo)基因編碼蛋白在小鼠曲精小管和生精細(xì)胞中的定位；
　　6.通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建目標(biāo)基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒；
　　7.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞，建立過表達(dá)模型，分別采用RT-PCR和 Western blott

4、ing檢測(cè)細(xì)胞中靶基因的表達(dá)；
　　8.利用MTT法在細(xì)胞水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖狀況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡變化。
　　結(jié)果：
　　1.利用生物信息學(xué)對(duì)酵母雙雜交篩選的spata3相關(guān)作用蛋白進(jìn)行分析，推測(cè)常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸 N-甲基轉(zhuǎn)移酶2(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase2, Ehmt2)，突觸素樣蛋白(synaptophysin-li

5、ke protein, Sypl)，環(huán)指和 CHY鋅指結(jié)構(gòu)域1(ring finger and CHY finger domain containing1, Rchy1)和絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase2, SRPK2)可能在精子發(fā)生過程中與spata3有密切聯(lián)系；
　　2.半定量RT-PCR和Western blotting分析顯示SRPK2

6、和Sypl的mRNA和蛋白在小鼠睪丸中均大量表達(dá)；
　　3.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示SRPK2 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)呈規(guī)律性增強(qiáng)，具有明顯的階段特異性表達(dá)特征；
　　4.Western blotting在蛋白水平檢測(cè)到SRPK2蛋白有明顯的階段特異性表達(dá)；
　　5.免疫組化和免疫熒光染色結(jié)果表明SRPK2蛋白主要位于長(zhǎng)形精子細(xì)胞核表面；
　　6.雙酶切分析及DNA序列測(cè)定結(jié)果均表明真核表達(dá)質(zhì)粒p3×Flag-SRPK

7、2構(gòu)建成功；
　　7.經(jīng)RT-PCR和Western blotting檢測(cè)，SRPK2基因在轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)；
　　8.過表達(dá)SRPK2的Hela細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)，使G1期明顯降低(P<0.05)，凋亡率明顯減少(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.SRPK2基因在小鼠睪丸中高表達(dá)，并具有顯著的階段特異性表達(dá)特征和明確的細(xì)胞定位，極有可能在小鼠精子發(fā)生的變態(tài)成形期參與mR