內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白HAC1和分子伴侶HSP70在瑞氏木霉中的表達(dá)以及重組菌株糖基化模式檢測.pdf

1、絲狀真菌是一種新的極具希望的真核生物表達(dá)系統(tǒng)，它不僅具有微生物生長快速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，還具有真核生物典型的翻譯后修飾作用及強(qiáng)大的蛋白（主要為酶類）分泌能力，近年來，瑞氏木霉已作為基因工程宿主菌應(yīng)用于外源真核蛋白的生產(chǎn)，但絲狀真菌生產(chǎn)異源蛋白的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于內(nèi)源蛋白（每升發(fā)酵液數(shù)十克），達(dá)不到工業(yè)發(fā)酵規(guī)模的需求。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已從多角度研究采取諸如增加基因拷貝數(shù)、利用強(qiáng)啟動子表達(dá)等策略以提高外源蛋白的表達(dá)，并取得了一定的結(jié)果。本論文工

2、作采用過表達(dá)非折疊蛋白響應(yīng)（unfolded protein response，UPR）相關(guān)基因的辦法進(jìn)一步促進(jìn)外源真核蛋白分泌量的提高。 非折疊蛋白響應(yīng)（UPR）是調(diào)節(jié)蛋白加工分泌的重要機(jī)制，當(dāng)過量表達(dá)異源蛋白時(shí)，多肽鏈不能及時(shí)正確折疊而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，激活UPR途徑，提高蛋白二硫鍵異構(gòu)酶和分子伴侶等相關(guān)蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)滯留蛋白的重新折疊，從而增加蛋白的分泌量。 本文工作克隆了瑞氏木霉UPR調(diào)控基因hca

3、l和分子伴侶hsp70基因，利用重組PCR技術(shù)將hacl基因表達(dá)盒PgpdA-hacl-TtrpC插入帶有硫胺素抗性基因的自主復(fù)制質(zhì)粒pME2892中，得到hacl表達(dá)載體pME-hac；利用相同方法將hsp70基因表達(dá)盒PtrpC-hsp-TtrpC插入到帶有硫胺素抗性基因的表達(dá)載體T-ptrA中，得到hsp70單表達(dá)載體TptrA-hsp；再將其插入到pME-hac中，構(gòu)建了攜帶有hac和hsp70基因雙表達(dá)盒的載體pME-hach

4、sp。 pME-hac、TptrA-hsp和pME-hachsp分別轉(zhuǎn)化經(jīng)過初步糖基化改造、同時(shí)表達(dá)促紅細(xì)胞生成素（EPO）的重組菌株T．reesei 47和T．reesei 112，在含有適量抗硫胺素的再生基本培養(yǎng)基平板上篩選，以T．reesei 47為出發(fā)菌株分別得到20、9、4個(gè)硫胺素抗性轉(zhuǎn)化子：以T．reesei 112為出發(fā)菌株分別得到10、12、5個(gè)硫胺素抗性的轉(zhuǎn)化子。在含有抗硫胺素的基本培養(yǎng)基平板上進(jìn)行復(fù)篩，分別

5、挑取單菌落培養(yǎng)經(jīng)PCR驗(yàn)證，從6種穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子中分別挑選得到T47-hac、T47-hsp、T47-hachsp、T112-hac、T112-hsp和T112-hachsp轉(zhuǎn)化菌株。 在分子水平和蛋白水平對轉(zhuǎn)化子T47-hac、T47-hsp、T47-hachsp、T112-hac、T112-hsp和T112-hachsp進(jìn)行了驗(yàn)證：southern Blot分析結(jié)果證實(shí)，hsp基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化子T47-hsp和T112

6、-hsp的染色體上， hachsp雙基因表達(dá)盒已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化子T47-hachsp的染色體上。SDS-PAGE檢測顯示，轉(zhuǎn)化子T47-hsp的胞內(nèi)總蛋白在約70KD處比出發(fā)菌株T47多1條蛋白帶，這條帶應(yīng)該就是HSP70蛋白帶，與預(yù)期大小相符，證明hsp70基因在T112-hsp中成功表達(dá)。 轉(zhuǎn)化子T47-hsp和T112-hsp胞外蛋白總量及外切纖維二糖水解酶Ⅰ（CBHI）酶活力檢測結(jié)果表明，過量表達(dá)基因hsp對瑞氏木霉胞

7、外蛋白總量的提高沒有顯著影響，但對CBHI酶活力測定結(jié)果顯示T47-hsp菌株的CBHI酶活力比出發(fā)菌株T47提高30％； T112-hsp的CBHI酶活力比出發(fā)菌株T112提高達(dá)80％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在絲狀真菌中表達(dá)UPR途徑相關(guān)基因能提高內(nèi)源或外源蛋白的表達(dá)，這是提高工業(yè)菌株外源蛋白產(chǎn)量的一個(gè)有效的途徑，對構(gòu)建具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)生產(chǎn)菌株有廣泛的應(yīng)用前景。 絲狀真菌的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)與酵母相比，其N-糖基化類型更接近

8、人源糖蛋白的寡聚糖類型，但仍然與哺乳動物存在著一定的差別。為使瑞氏木霉的糖基化修飾系統(tǒng)盡可能與人相同，必須進(jìn)一步進(jìn)行遺傳改造。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)得到了兩株對糖基化途徑進(jìn)行初步改造的瑞氏木霉重組菌株T108和GF4，但還沒有對T108和GF4菌株糖蛋白的糖基化模式進(jìn)行檢測。本文利用陰離子交換層析柱和葡聚糖凝膠層析柱分離純化了T108、GF4和出發(fā)菌株M23的糖蛋白CBHI。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，T108和GF4的CBHI蛋白分子

9、量都變小，證實(shí)T108中表達(dá)的N-乙酰葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶基因和GF4中敲除α-1，3-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶基因成功表達(dá)并改變了糖蛋白的糖基化修飾方式。用糖酰胺酶F酶解CBHI蛋白，釋放糖鏈，進(jìn)行了SDS-PAGE檢測，切除糖鏈的蛋白和未切除糖鏈的蛋白在SDS-PAGE電泳上由于蛋白分子量變化而出現(xiàn)蛋白條帶遷移，并產(chǎn)生40 KD左右大小的條帶，推測該條帶是被切除的糖類物質(zhì)。 本實(shí)工作證實(shí)對瑞氏木霉進(jìn)行的糖基化改造取得了初步的結(jié)果，為瑞氏