瑞氏木霉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊因子突變株的構建及性質(zhì)分析.pdf

1、地球上的生命過程依賴于植物的光合作用，光合作用可以產(chǎn)生大量的以木質(zhì)纖維素為主要組分的生物質(zhì)，所以木質(zhì)纖維素是地球上存在的可持續(xù)滿足人類生存和發(fā)展需要的規(guī)模最大的可再生資源。隨著石油資源的枯竭及人類社會對環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的要求，開發(fā)利用清潔、環(huán)境友好型能源成為人類社會的廣泛共識。利用微生物技術高效轉(zhuǎn)化纖維素類可再生資源，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇、乳酸等液體燃料和各種化工產(chǎn)品，對于我們這樣一個人口眾多，能源和資源緊張的國家具有十分重要的戰(zhàn)略意義、現(xiàn)實意義

2、和廣闊的發(fā)展前景。
　　 瑞氏木霉（Trichoderma reesei)是一株重要的纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)菌株，它有很高的分泌纖維素酶降解木質(zhì)纖維素的能力。2008年其基因組測序結果表明，與其它已經(jīng)完成測序的絲狀真菌相比，瑞氏木霉基因組中糖苷水解酶的編碼基因較少;而前期研究結果表明:在瑞氏木霉體內(nèi)，主要的纖維素酶組分纖維二糖水解酶Ⅰ(CBHI)的生物合成過程需要4分鐘，而其分泌過程則需要11分鐘完成，這要比酵母或其它絲狀真菌細胞內(nèi)蛋

3、白的分泌時間長。初步推測，瑞氏木霉的高纖維素降解能力并不是由其所分泌纖維素酶系的多樣性決定，而可能取決于其體內(nèi)存在的較強的蛋白分泌能力。研究發(fā)現(xiàn)，真核生物細胞中轉(zhuǎn)錄翻譯的內(nèi)源尤其是外源蛋白如果不能高效地進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不能高效地正確折疊將引發(fā)非折疊蛋白應急反應(unfolded protein response，UPR)，協(xié)調(diào)各種其它蛋白因子參與協(xié)助分泌蛋白的有效折疊和分泌，同時亦可能反饋抑制所分泌蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達。因此與纖維

4、索酶基因的誘導轉(zhuǎn)錄相比，其纖維素酶的高效分泌更可能是限制其大量表達的主要瓶頸。綜上所述，本論文的研究工作主要包括以下兩個
　　 方面:
　　 1.瑞氏木霉蛋白折疊因子Calnexin及PrpA缺失菌的構建及性質(zhì)測定
　　 凝集素蛋白Calnexin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)重要的分子伴侶，它可以識別只有一個葡萄糖殘基的N-糖鏈并與之結合，從而輔助糖蛋白多肽鏈的折疊;而PrpA(PDIrelated protein A)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)

5、涉及蛋白折疊的PDI相關蛋白。在有纖維素酶的誘導底物存在的條件下，它們的轉(zhuǎn)錄量明顯提高。首先在瑞氏木霉內(nèi)將Calnexin及PrpA的編碼基因進行敲除，并對缺失菌的性質(zhì)進行初步測定。對獲得的缺失菌的性質(zhì)進行了初步測定，發(fā)現(xiàn)Calnexin和PrpA缺失后并沒有影響菌體在各種碳源上的生長。在纖維素底物存在的誘導條件下，prpA缺失菌所分泌的總蛋白量及酶活與野生型沒有明顯區(qū)別，而cnel缺失菌雖然分泌的總蛋白量與野生型沒有明顯變化，但是pN

6、PC和pNPG水解酶活性都要明顯高于野生型菌株。
　　 2.△cnel菌株CBHI的產(chǎn)生分泌、穩(wěn)定性分析及分離純化
　　 由于Calnexin是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的重要的分子伴侶，它的缺失可能會給菌體帶來以下兩個方面的影響:(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制系統(tǒng)的嚴謹性受到破壞，非正確折疊的蛋白可以被分泌到胞外，而這種非正確折疊蛋白可能由于構象的改變使缺失菌與野生型產(chǎn)生了明顯的表型差異;(2)多肽鏈的折疊受到影響，不能夠正常分泌而滯留引起

7、胞內(nèi)產(chǎn)生一系列復雜的非折疊蛋白應急反應。所以為深入分析Calnexin缺失菌的表型，我們對缺失菌分泌的主要纖維素酶CBHI的產(chǎn)生分泌情況及穩(wěn)定性進行了分析，并對分泌到胞外的CBHI進行分離純化。結果表明:
　　 Calnexin缺失后，主要的纖維素酶組分CBHI在誘導12小時時便可檢測到較強的胞內(nèi)信號，并且隨著誘導時間的延長，胞內(nèi)信號強度逐漸減弱;而在胞外分泌CBHI的含量及其穩(wěn)定性方面，△cnel菌株與野生型卻沒有明顯區(qū)別。<

8、br>　　 發(fā)酵液中的酶組分經(jīng)過濃縮后通過兩步離子交換層析進行分離純化，并對得到的純組分的pNPC水解酶活性進行測定。結果表明:△cnel菌株分泌產(chǎn)生的CBHI的pNPC水解酶活性與野生型并沒有明顯差別;而對菌體發(fā)酵液中全蛋白進行檢測時，發(fā)現(xiàn)△cnel菌株與野生型菌株間存在著一條明顯的差異蛋白，該差異蛋白通過質(zhì)譜鑒定被確定為β-葡萄糖苷酶Cel3b，所以△cnel菌株較高的pNPC水解酶活性可能是由這一差異蛋白引起。
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