瑞氏木霉內切葡聚糖酶Ⅱ蛋白質工程改造和表達研究.pdf

1、纖維素酶已經被成功應用于紡織、造紙、食品、飼料工業(yè)，并且隨著生物能源工業(yè)的出現，其市場潛力越來越大。當纖維素酶被用于紡織、造紙等纖維加工工業(yè)中時，往往需要接觸一些偏堿性的環(huán)境。而大多真菌纖維素酶由于在高pH下活力喪失嚴重，其應用受到諸多限制。許多研究者希望通過蛋白質工程的手段改造纖維素酶并獲得其最適pH和酶活力均有所上升的突變體酶。 釀酒酵母由于其轉化和表達的高效性是一種良好的分子改造的宿主。許多來源于真菌的纖維素酶已經被表達于

2、釀酒酵母中，并獲得了具有活性的重組酶蛋白。內切葡聚糖酶Ⅱ(EGⅡ)是瑞氏木霉中最主要的內切酶之一，刪除EGⅡ的瑞氏木霉其內切酶活性喪失了55％以上。在本實驗室前期的工作中，從使用釀酒酵母H158構建的瑞氏木霉cDNA文庫中獲得了內切葡聚糖酶Ⅱ的基因eg2，并利用的定向進化方法篩選到一個最適pH有所提高的突變體。 通過進一步研究釀酒酵母中表達的重組內切葡聚糖酶Ⅱ(rEGⅡ)的酶學性質和使用定向進化的手段提高其功能，可以進一步闡明酶

3、的結構和其最適pH的關系。這不僅可使瑞氏木霉內切葡聚糖酶更好的應用于偏堿性環(huán)境，也為研究蛋白質的結構與功能的關系提供了有用的數據和信息。 本文的研究成果主要如下： 1.分析了糖基化對rEGII的影響首先建立了表達于釀酒酵母H158的rEG Ⅱ的分離純化的方法，并進行了SDS-PAGE后的活性染色：發(fā)現重組EG Ⅱ具有能吸附于陽離子瓊脂糖凝膠的C1和不能吸附的C2兩部分℃1部分是一個分子量57 KDa的蛋白，經內切糖苷酶H

4、(Endo H)酶解去除N糖基化后，其分子量下降為54 KDa，并保持大約88％的酶活力℃2部分是一個大分子量蛋白的集合體，經Endo H酶解后，其分子量同樣下降為54 KDa。重組C1和C2部分對底物的降解能力和來源于瑞氏木霉本身的native-EG Ⅱ相似：C2部分具有對更高pH的適應性和更好的耐溫性。 2.分析了rEG II第124位去N-糖基化后對重組酶性質的影響使用重疊延伸的方法對rEG II的N-糖基化位點N124進

5、行了定點突變，獲得了N124D和N124H的突變體。重組N124D和N124H的突變體酶同樣具有C1和C2兩部分，其C1部分的分子量為54 KDa，和經Endo H處理過的野生型的C1部分相同，顯示去除N糖基化為其分子量的降低的原因。使用粗酶液測定了它們的胞外CMCase活性、最適pH和對溫度的適應性，未發(fā)現去除N-糖基化的突變蛋白和野生型蛋白在以上酶學性質上有明顯區(qū)別。 3.對rEG II的第342位位點進行了飽和突變和突變酶

6、性質分析，探討了此位點在影響rEG II酶學性質上的作用實現了對于來源于瑞氏木霉的內切葡聚糖酶II的第342位位點的飽和突變，分析了此位點的突變對酶蛋白最適pH和酶活性的影響。將突變氨基酸分成3類，發(fā)現帶有脂肪側鏈的氨基酸的突變，如突變體N342V，N342I，N342L均可以使酶蛋白的最適pH向中性發(fā)生偏移。最大的偏移發(fā)生在N342R的突變體上，帶來了最適pH大約1.2的偏移，但其酶活力較野生型有大幅度下降。同屬于堿性氨基酸突變的N3

7、42K并未帶來最適pH的改變。同源建模顯示，N342位于EG II外層α螺旋的C端。推測側鏈的增大和H鍵的增多使螺旋更加的穩(wěn)定，從而影響了酶在高pH下的活力。 4.使用易錯PCR和DNA重排的方法實現了對rEG II的定向進化，獲得了幾個酶學性質有一定改良的突變體使用定向進化(包括隨機突變和DNA重排)的手段實現了對rEG II的改造。純化的突變體酶中，N39R/L218HAV276R/N342T的最適pH可以達到6.0～6.2

8、，在pH 6.2時催化效率較野生型提高了1.4倍。L218H和Q139R/N342T盡管其最適pH變化不大，但其在pH 7.0時的催化效率較野生型提高了4倍。突變體結構和功能的分析表明，更多穩(wěn)定的螺旋和催化殘基以及底物之間靜電作用的改變是突變體酶性質較野生型酶發(fā)生改變的原因。 5.對糖苷水解酶家族5中纖維素內切酶信息學研究對糖苷水解酶家族5中纖維素內切酶的氨基酸序列以及最適pH的數據進行了收集，初步探究了氨基酸組成對纖維素內切酶

9、最適pH的影響。研究了纖維素內切酶中H+R、C+Y含量與最適pH的關系：發(fā)現隨著H+R含量的上升，纖維素內切酶的最適pH有所上升；隨著C+Y含量的上升，纖維素內切酶的最適pH有所下降。收集到7個已知最適pH和已知晶體結構的纖維素內切酶，并和瑞氏木霉EG II的性質進行了比對，它們的三級結構非常相似，酶解機制相同但具有完全不同的最適pH。 6.建立了高效的黑曲霉原生質體制備和再生的方法為進一步提高重組酶蛋白的表達量，探索了建立黑曲

10、霉轉化表達系統的方法。結果表明，培養(yǎng)14 h的幼嫩菌絲體最適于制備原生質體，選用0.6 M KCl為最適滲透壓穩(wěn)定劑，3g/L蝸牛酶-4.5g/L纖維素酶-1.5g/L溶壁酶為裂解酶組合，32 ℃，酶解2 h，原生質體的形成量可達到106～107。采用雙層平板法培養(yǎng)，原生質體再生率可達45％。使用改良轉化液，自主復制型質粒ANEp7轉化黑曲霉N593的轉化率為大約30個/μg質粒。 7.瑞氏木霉內切葡聚糖酶Ⅱ在黑曲霉中的表達構建