基于二代測(cè)序技術(shù)的MEN2A全基因組測(cè)序分析和6個(gè)EPPK家系的基因突變譜及產(chǎn)前DNA診斷研究.pdf

1、背景:(1)2型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤(MEN2)是一種以甲狀腺、腎上腺髓質(zhì)和甲狀旁腺內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)生增生或腫瘤為主要特征的腫瘤，一般呈常染色體顯性遺傳。MEN2可分為3種亞型:2A型(MEN2A)、家族性甲狀腺髓樣癌型(FMTC)和2B型(MEN2B)。原癌基因RET是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一與MEN2發(fā)病相關(guān)的基因。其中，第634位氨基酸的點(diǎn)突變占MEN2A的80％～90％，又以p.Cys634Arg癥狀最為嚴(yán)重;(2)表皮松解性掌跖角化癥(E

2、PPK)是相對(duì)常見的致殘性常染色體顯性遺傳性皮膚病，迄今無有效的臨床治療手段。本病主要由角蛋白KRT9基因的突變?cè)斐?，外顯率100％;少數(shù)患者由KRT1基因突變引起。
　　目的:(1)利用全基因組測(cè)序技術(shù)(WGS)在基因突變篩查中的高效性和全面性優(yōu)勢(shì)綜合分析MEN2A疾病形成的分子病因，探究RET基因內(nèi)含子、可變剪接區(qū)等的變異是否與MEN2A的發(fā)生、臨床癥狀、腫瘤轉(zhuǎn)移以及發(fā)病年齡有關(guān);(2)繪制本研究所收集到的EPPK家系基因突變

3、譜，分析EPPK表型與致病基因KRT9基因型之間的相關(guān)性。順應(yīng)相關(guān)患者和親屬的強(qiáng)烈要求，在明確致病基因突變后，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前DNA診斷。
　　方法:(1)收集了1個(gè)MEN2A家系（11例家族成員），對(duì)先證者進(jìn)行全基因組測(cè)序。過濾dbSNP、1000 Genome Project和HapMap等數(shù)據(jù)庫(kù)，選取其中1個(gè)內(nèi)含子的InDel進(jìn)行亞克隆測(cè)序驗(yàn)證。通過PCR-DNA測(cè)序?qū)蚁?1例成員進(jìn)行RET進(jìn)行RET基因20個(gè)外顯子的突變驗(yàn)

4、證和多態(tài)性篩查。(2)收集了6個(gè)EPPK家系。通過PCR-DNA測(cè)序及AS-PCR、微衛(wèi)星DNA多態(tài)性連鎖分析，篩查和驗(yàn)證相關(guān)KRT9和KRT1基因的突變。繼而，對(duì)4個(gè)EPPK家系的高風(fēng)險(xiǎn)患病胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前DNA診斷。
　　結(jié)果:(1)通過對(duì)先證者的WGS數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，其RET基因第11號(hào)外顯子存在c.1900T＞C（p.Cys634Arg）突變。通過Sanger DNA測(cè)序法對(duì)MEN2A家系11例成員進(jìn)行篩查驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Ⅱ∶1、

5、Ⅱ∶7和Ⅲ∶4存在該位點(diǎn)突變，證實(shí)了WGS技術(shù)的精確性和高效性。亞克隆測(cè)序驗(yàn)證了Ⅱ∶1和Ⅱ∶7存在RET第2外顯子區(qū)上游71 bp處（第43595836核苷酸位點(diǎn)，內(nèi)含子區(qū)）的InDel;(2)在本研究所涉及的6個(gè)EPPK家系或散發(fā)病例中存在3種KRT9雜合突變，分別為2個(gè)c.487C＞T（p.Arg163Trp）突變家系，1個(gè)c.488G＞A（p.Arg163Gln）突變家系，2個(gè)c.482A＞G(p.Asn161Ser)突變家系;1

6、個(gè)EPPK家系患者未發(fā)現(xiàn)任何KRT9或KRT1突變。利用羊水基因組DNA-PCR-Sanger DNA測(cè)序法，成功地完成了4例產(chǎn)前DNA診斷，其中2例為正常胎兒，2例為致病基因突變攜帶胎兒。
　　結(jié)論:(1)在國(guó)際上首次將全基因組測(cè)序技術(shù)用于MEN2A的研究。在RET基因第2外顯子區(qū)上游71 bp處（第43595836核苷酸位點(diǎn)，內(nèi)含子區(qū)）發(fā)生的InDel突變，可能對(duì)mRNA的剪接造成影響，使其拼接異常，不能編碼正常的氨基酸序列，