屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥致病基因全基因組外顯子測序搜尋及POFUT1基因突變分析.pdf

1、研究背景：屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥（Reticular pigmented of the flexures，RPAF,OMIM number:179850）又稱為Dowling-Degos?。―owling-Degos disease，DDD），是一種少見的常染色體顯性遺傳性皮膚病。早期有學者認為該病是黑棘皮病的一種良性異型。1978年，Wilson-Jone等正式將該病命名為屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥。該病好發(fā)于腕部、頸部、腋窩、腹股溝、乳房下及四

2、肢屈側(cè)等，臨床上主要表現(xiàn)為網(wǎng)狀分布的深褐色斑疹。男女均可發(fā)病，發(fā)病年齡變化較大，從青春期早期到中年期不等。2006年，Betz等對2個屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥家系行全基因組掃描，將致病基因定位于12q，LOD值為4.42。此區(qū)域含有Ⅱ型角蛋白，對這些角蛋白基因測序發(fā)現(xiàn)，2個家系中的患者均在角蛋白5（keratin5，KRT5）存在突變，對照人群無突變，從而確定角蛋白5為DDD的致病基因。但，仍有一些家系或散發(fā)病例未在該基因上發(fā)現(xiàn)任何突變。20

3、06年，Li等對1個中國DDD家系行全基因組掃描，將該病的致病基因定位于17p13.3。該區(qū)域包含21個已知基因和16個預測基因，至今該區(qū)域的致病基因尚未克隆出。這說明DDD具有一定的遺傳異質(zhì)性。
　　目的：對1個中國屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常癥家系（家系Ⅰ）進行全基因組連鎖和全基因組外顯子測序分析，經(jīng)過逐步的濾過和與家系Ⅰ無血緣關系的 DDD樣本的驗證，篩選出該病的致病基因。
　　方法：(1)經(jīng)過嚴格篩查，2個DDD家系和1個DDD

4、散發(fā)患者納入了本次研究。對參加初篩的 DDD家系進行全基因組分型，本次所采用的芯片為Illumina-660W-Beadchips。應用Merlin軟件進行連鎖分析，根據(jù)LOD值確定候選區(qū)域，然后進行單倍型共分離，確定表型與染色體共分離的區(qū)域。（2）利用Genome AnalyzerⅡx對該家系的成員進行全基因組外顯子捕獲。（3）注釋所有檢測到的變異體的功能，分類為無義突變（nonsense mutation）、錯義突變(missens

5、e mutation)、編碼區(qū)插入或缺失突變（coding indels，I)、同義突變（samesense mutation）、剪切位點突變（splice acceptor and donor site，SS)和非編碼區(qū)突變（Non-coding region mutation）等，篩選出可能影響基因功能的突變，如編碼區(qū)插入或缺失、非同義突變（nonsysnonymous，NS)、剪切位點突變。在可得的公共數(shù)據(jù)庫中(HapMap外顯子

6、組、dbSNP129,和千人基因組變異體數(shù)據(jù)庫)過濾2個DDD患者的可影響基因功能的突變，再與2個對照者的分析結(jié)果進行對比。2個患者共有的，2個對照者沒有的，公共數(shù)據(jù)庫中沒有的變異體即為候選變異體。
　　進一步評估上述的候選變異體對基因功能的影響，結(jié)合連鎖分析所定位的染色體區(qū)域，進而篩選出DDD可能的候選致病基因。(4)對初篩家系的候選致病基因行Sanger測序，篩選出表型共傳遞的變異體。(5)通過Sanger測序在其他家系的患者

7、和散發(fā)患者中檢驗候選致病基因。之后，對大樣本的對照者的該基因進行分析，排除多態(tài)性。
　　結(jié)果：(1)本課題組對 DDD家系Ⅰ應用全基因組連鎖分析(Genome-wide linkage analysis)方法將LOD值=1.5的表型與染色體共分離的區(qū)域定位在染色體20:17,722,478-36,009,145。(2)對全基因組外顯子測序結(jié)果進行對比、過濾等分析發(fā)現(xiàn)，患者共有，而對照者、公共數(shù)據(jù)庫未攜帶的突變位點為42個，其中突變

8、點（c.246+5delG）位于連鎖分析定位的候選區(qū)域內(nèi)的POFUT1基因上。(3)進一步對家系I中的5名患者和8名正常人的POFUT1進行Sanger測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所用患者和1個12歲的男孩（該家系的發(fā)病年齡為20歲左右）攜帶突變位點POFUT1（c.246+5delG）,家系內(nèi)所有對照和100名正常人均不攜帶該突變。其余1個家系和1個散發(fā)患者沒有在POFUT1上發(fā)現(xiàn)突變位點。
　　結(jié)論：（1）本研究通過全基因組連鎖分析和全基因