太湖水華優(yōu)勢(shì)藻的環(huán)境特性及藻-菌作用機(jī)制.pdf

1、近年來(lái)，太湖頻繁爆發(fā)藍(lán)藻水華，造成水質(zhì)惡化和湖泊生態(tài)退化，成為影響水資源環(huán)境、制約經(jīng)濟(jì)與社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要因素。研究顯示太湖水華優(yōu)勢(shì)藻為微囊藻，但關(guān)于藍(lán)藻、微囊藻、產(chǎn)毒微囊藻在太湖水華中的豐度、分布以及影響因素等生態(tài)特性研究極少，關(guān)于太湖產(chǎn)毒微囊藻類的產(chǎn)毒特性和產(chǎn)毒效率的研究尚未見報(bào)道。本研究擬建立基于全細(xì)胞PCR、RTQ-PCR技術(shù)、能對(duì)藻類環(huán)境豐度以及產(chǎn)毒能力進(jìn)行測(cè)定與分析的檢測(cè)方法；并對(duì)太湖水華藻的種類、環(huán)境生態(tài)特征以及太湖

2、產(chǎn)毒微囊藻的產(chǎn)毒特性進(jìn)行分析；進(jìn)一步研究太湖土著斑點(diǎn)氣單胞溶藻菌的溶藻作用與機(jī)制。預(yù)期結(jié)果為太湖水華的治理提供有效技術(shù)手段和重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 一、基于PCR的藍(lán)藻、微囊藻、產(chǎn)毒微囊藻及其產(chǎn)毒特性檢測(cè)方法的建立
　　 利用針對(duì)藻藍(lán)蛋白中間基因序列（PC-IGS），微囊藻16s rDNA保守序列（Micr16s rDNA）以及微囊藻毒素合成酶基因B（mcyB）的特異性引物，以FACHH7806標(biāo)準(zhǔn)銅綠微囊藻為陽(yáng)性藻株，建

3、立檢測(cè)藍(lán)藻、微囊藻以及微囊藻毒素合成酶基因B的全細(xì)胞PCR檢測(cè)法，并對(duì)全細(xì)胞PCR檢測(cè)法的靈敏度、特異度進(jìn)行測(cè)定。建立的全細(xì)胞PCR快速檢測(cè)方法不受藻細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期的影響，也不受其它藻類細(xì)胞或雜菌的干擾。靈敏度測(cè)試結(jié)果表明，取10μL藻細(xì)胞樣品為模板，在30μL反應(yīng)體系中，PC-IGS的檢測(cè)下限為1000cells/反應(yīng)，mcyB的檢測(cè)下限為10000cells/反應(yīng)；在25μL反應(yīng)體系中，Micr16s rDNA的檢測(cè)下限為10000c

4、ells/反應(yīng)。
　　 應(yīng)用SYBR GreenⅠ標(biāo)記技術(shù)，與上述的PCR條件相結(jié)合，建立了實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)藍(lán)藻、微囊藻屬、產(chǎn)毒微囊藻在環(huán)境中的相對(duì)豐度的RTQ-PCR方法。該方法對(duì)藍(lán)藻的檢測(cè)范圍為106-1011基因拷貝數(shù)/μL（R2=0.9941），微囊藻屬的檢測(cè)范圍為104-109基因拷貝數(shù)/μL（R2=0.9936），微囊藻毒素合成酶基因B的檢測(cè)范圍為102-105基因拷貝數(shù)/μL（R2=0.9951）。藍(lán)藻、微囊藻、微

5、囊藻毒素合成酶基因B初始拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式分別為：Ct=-3.1466Lg Copy number+45.816，Ct=-3.0369Lg Copy number+42.551，Ct=-3.3120 Lg Copy number+31.297。
　　 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室研究的SPE-HPLC提取、分析微囊藻毒素的技術(shù)，繪制MC-LR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)方法靈敏度、回收率和精密度進(jìn)行測(cè)定，提出以單位藻細(xì)胞產(chǎn)MC-LR的量反

6、映藻細(xì)胞的產(chǎn)毒能力的概念。結(jié)果顯示，建立的HPLC檢測(cè)法對(duì)MC-LR檢測(cè)的濃度范圍為0.1-10.0μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=38.797x+17.536（r=0.9990），平均回收率為92.1％，變異系數(shù)為5.8％。
　　 二、太湖水華優(yōu)勢(shì)藻環(huán)境特性的研究
　　 利用全細(xì)胞PCR檢測(cè)法對(duì)自太湖梅梁灣分離獲得的兩株藻株TH1、TH2進(jìn)行鑒定，并結(jié)合HPLC、RTQ-PCR對(duì)產(chǎn)毒株TH1的產(chǎn)毒特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，自太

7、湖梅梁灣分離獲得的TH1藻株為產(chǎn)毒微囊藻，TH2為不產(chǎn)毒微囊藻。培養(yǎng)15天的太湖產(chǎn)毒藻株TH1胞外藻毒素產(chǎn)量為0.085±0.017μg/108cells，總藻毒素產(chǎn)量為0.594±0.023μg/108cells。太湖產(chǎn)毒藻株TH1微囊藻毒素合成酶基因B的表達(dá)能力為FACHH7806標(biāo)準(zhǔn)銅綠微囊藻的1/16.826。
　　 對(duì)太湖南泉水域進(jìn)行了為期一年的水質(zhì)、藻類環(huán)境豐度和產(chǎn)毒能力的監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，南泉水域的水污染程度與

8、富營(yíng)養(yǎng)化程度均為中度：5～11月總藻密度均超過(guò)水華閾值（106cells/L），9月份達(dá)到109cells/L_的最高值；微囊藻是太湖南泉地區(qū)的優(yōu)勢(shì)藻，其環(huán)境豐度維持在80～90％左右；產(chǎn)毒微囊藻的環(huán)境豐度在5～10月均高于40％，隨著水溫的下降，其環(huán)境豐度迅速降低并在12月降到了5.66％；總藻產(chǎn)MC-LR的能力在6、11月份，分別出現(xiàn)兩個(gè)峰值；產(chǎn)毒微囊藻產(chǎn)MC-LR的能力為1.661～9.293μg/億細(xì)胞。11～12月隨著水溫和藻

9、密度的急速下降，產(chǎn)毒微囊藻產(chǎn)MC-LR的能力顯著增強(qiáng)。結(jié)果提示太湖南泉水域全年大部分時(shí)間存在水華，微囊藻為其優(yōu)勢(shì)藻，產(chǎn)毒微囊藻的環(huán)境豐度及其產(chǎn)MC-LR能力的動(dòng)態(tài)變化與水溫密切相關(guān)。冬季產(chǎn)毒微囊藻產(chǎn)毒能力顯著增強(qiáng)。因此，在水華和非水華期內(nèi)，對(duì)有害藻華的防制都應(yīng)予以重視。
　　 三、斑點(diǎn)氣單胞溶藻菌除藻作用與溶藻活性物質(zhì)的研究
　　 斑點(diǎn)氣單胞菌對(duì)濃度為106cells/mL，的標(biāo)準(zhǔn)藻、太湖野生微囊藻TH1和TH2的48h

10、溶藻率分別為65.82％、78.04％和82.67％。其溶藻活性隨溶藻菌濃度升高而增強(qiáng)，104-107cells/mL的斑點(diǎn)氣單胞菌48h溶藻率分別為16.25％、18.75％、48.75％、81.25％。其溶藻活性強(qiáng)弱與藻細(xì)胞初始濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，對(duì)103-106個(gè)/mL藻細(xì)胞48h溶藻率分別為100％、100％、90.24％、80.46％。處于不同生長(zhǎng)周期的斑點(diǎn)氣單胞溶藻菌對(duì)藻細(xì)胞的溶解能力差異較大，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定生長(zhǎng)期、衰退期的斑

11、點(diǎn)氣單胞溶藻菌對(duì)106/mL，藻細(xì)胞48h溶藻率分別為30.54％、53.75％、72.50％。其對(duì)處于不同生長(zhǎng)周期的銅綠微囊藻溶藻能力略有不同，對(duì)濃度為106/mL，處于對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期的銅綠微囊藻48h溶藻率分別為47.34％、53.41％、74.68％。溫度對(duì)其溶藻影響較大，隨著溫度的升高，溶藻能力升高，15℃、25℃、35℃組對(duì)106/mL藻細(xì)胞48h溶藻率依次為25.35％、56.71％、72.73％。斑點(diǎn)氣單胞溶藻菌主

12、要通過(guò)分泌胞外活性成分來(lái)溶解藻細(xì)胞。在30-120℃范圍內(nèi)，溫度升高有助于提高胞外活性成分的除藻能力。在pH5-9的范圍內(nèi)，偏堿性條件有助于提高胞外活性成分的除藻能力。石油醚、氯仿、乙酸乙酯等不同極性有機(jī)溶劑萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著有機(jī)溶劑極性的升高，溶劑有機(jī)相萃取到的活性成分就越多。<2kDa活性組分48h溶藻作用是胞外濾液溶藻作用的87.27％?？寡趸瘻y(cè)試發(fā)現(xiàn)胞外濾液在常溫下放置4天后，溶藻活性降低了55％，而添加了1％的抗壞血酸（V

13、c）的胞外濾液溶藻率僅僅只下降了4％。乙醇沉淀實(shí)驗(yàn)顯示乙醇提取液48小時(shí)的溶藻作用是胞外濾液溶藻作用的92.17％，而醇析沉淀物幾乎沒有溶藻作用。斑點(diǎn)氣單胞菌胞外濾液中未檢測(cè)到含有多糖、蛋白質(zhì)、核酸、抗生素雖有檢測(cè)到，但乙醇沉淀實(shí)驗(yàn)否定了活性物質(zhì)為核酸的可能。
　　 溶藻活性物質(zhì)經(jīng)5倍體積的無(wú)水乙醇4℃冰箱中過(guò)夜抽提，抽提液經(jīng)離心（4000r/min，10min）后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)待無(wú)水乙醇完全蒸發(fā)，經(jīng)硅膠（100～200目）柱分離，以

14、氯仿/甲醇=2:1、1:1、0:1進(jìn)行梯度洗脫，得到兩個(gè)主要溶藻組分。紫外（365nm）燈下可見兩組分均呈現(xiàn)藍(lán)紫色熒光，組分1呈淡黃色，不定型顆粒狀，組分2呈棕黃色，油狀。兩組分均有一定的溶藻能力，但組分2的溶藻能力要強(qiáng)于組分1，推斷斑點(diǎn)氣單胞菌分泌的溶藻活性物質(zhì)為多組分抑藻物質(zhì)。官能團(tuán)顯色實(shí)驗(yàn)和紫外掃描結(jié)果提示斑點(diǎn)氣單胞菌分泌的溶藻活性物質(zhì)可能是含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的胺類還原性物質(zhì)。LC/MS-IT-TOF分析結(jié)果顯示斑點(diǎn)氣單胞菌分泌的溶藻活