HA-PLGA膜預(yù)防宮腔粘連的初步研究.pdf

1、宮腔粘連又名As herman綜合征，是指宮腔前后壁之間形成的纖維粘連帶。它是宮腔操作手術(shù)后例如人工流產(chǎn)、診斷性刮宮，粘膜下肌瘤切除術(shù)等的常見并發(fā)癥，其最為嚴(yán)重的后果是繼發(fā)不孕。目前臨床上已有的預(yù)防措施包括：（1）術(shù)后口服雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)；（2）術(shù)后放置宮腔內(nèi)節(jié)育器；（3）宮腔內(nèi)安置氣囊尿管；（4）宮腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）凝膠。后三種方法運用了其物理屏障的作用使子宮內(nèi)膜的前后壁分隔開，但均存在一

2、定弊端。宮內(nèi)節(jié)育器以及尿管的安置需要再次手術(shù)取出，而透明質(zhì)酸凝膠在宮腔內(nèi)滯留時間較短，難以起到長時間的隔離作用。本實驗擬通過制備含透明質(zhì)酸的生物可降解膜，一方面生物可吸收膜可以起到更為持久的宮腔隔離的作用，并且逐步降解不需要再次手術(shù)取出；另一方面生物可吸收膜所載的 HA能起到干預(yù)子宮內(nèi)膜纖維化，從而起到預(yù)防宮腔粘連的作用。本實驗首先以子宮內(nèi)膜過度纖維化作為宮腔粘連的發(fā)病基礎(chǔ)，對宮腔粘連患者以及動物模型進(jìn)行了發(fā)病機制的初步研究。然后在宮腔

3、粘連動物模型上對透明質(zhì)酸預(yù)防宮腔粘連及其可能作用機制進(jìn)行了初步探討。為了保持透明質(zhì)酸在宮腔內(nèi)能夠起到更為持久的作用，制備了載HA的PLGA膜，對該膜的機械性能、藥物釋放、細(xì)胞毒性等方面進(jìn)行了研究。最后在動物模型中驗證了載HA的PLGA膜對宮腔粘連動物模型子宮內(nèi)膜纖維化的抑制作用?；谏鲜鲅芯课覀冋J(rèn)為載HA的 PLGA膜具有預(yù)防宮腔粘連的潛在價值，對其特性的進(jìn)一步研究將為其臨床運用提供更多的理論基礎(chǔ)。
　　第一部分宮腔粘連患者的子宮

4、內(nèi)膜纖維化程度研究
　　目的：
　　觀察宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜纖維化程度以研究纖維化是否參與宮腔粘連的形成。
　　方法：
　　運用Masson染色的方法比較宮腔粘連患者與正常婦女子宮內(nèi)膜纖維化程度。運用IHC的方法比較宮腔粘連患者與正常婦女子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　宮腔粘連組子宮內(nèi)膜的纖維化程度明顯高于正常婦女組(P<0.05)。宮腔粘連組子宮內(nèi)膜的纖維化相關(guān)蛋白 TGFβ1,

5、CTGF,CoⅠ,CoⅢ的表達(dá)明顯高于正常婦女組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　子宮內(nèi)膜的纖維化參與了宮腔粘連的發(fā)生。
　　第二部分宮腔粘連動物模型的建立及鑒定
　　目的：
　　建立宮腔粘連的雌性昆明小鼠動物模型并對其進(jìn)行鑒定，為后續(xù)的HA/PLGA膜預(yù)防宮腔粘連實驗提供動物模型。
　　方法：
　　將昆明雌性小鼠分為假手術(shù)組和損傷組，假手術(shù)組僅進(jìn)行開關(guān)腹的手術(shù)，損傷組進(jìn)行開腹后子宮內(nèi)膜的搔刮

6、和LPS的注射以造成內(nèi)膜的損傷。
　　運用Masson染色的方法對假手術(shù)組和損傷組子宮內(nèi)膜的纖維化程度進(jìn)行比較。運用IHC和WB方法對昆明雌性小鼠假手術(shù)組和損傷組的子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　損傷組子宮內(nèi)膜的纖維化程度明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），損傷組子宮內(nèi)膜的纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　經(jīng)過宮腔搔刮和宮腔注射LP S的方法能夠建立昆明雌

7、性小鼠的宮腔粘連動物模型，為后續(xù)實驗提供了基礎(chǔ)。
　　第三部分透明質(zhì)酸預(yù)防宮腔粘連的機制研究
　　目的：
　　探討不同分子量 HA對宮腔粘連小鼠動物模型的子宮內(nèi)膜纖維化程度的影響及其可能的作用機制。
　　方法：
　　在第二部分建立的小鼠宮腔粘連動物模型基礎(chǔ)上，將動物實驗分為對照組、HMW-HA組和LMW-H A組，后兩組于宮腔內(nèi)注射大分子及小分子HA。運用IHC和WB的方法對各組子宮內(nèi)膜纖維化程度以及纖維化

8、相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測。另原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，并分別加入PBS，TGFβ1，TGFβ1+HA，TGFβ1+HA+抗CD44阻斷抗體，并運用Western Blot和qPCR的方法檢測各組細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　HMW-HA組子宮內(nèi)膜的纖維化程度明顯小于對照組（P＜0.05），而LMW-HA組子宮內(nèi)膜纖維化程度與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。HMW-HA組子宮內(nèi)膜的纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯低于對照

9、組（P＜0.05），而LMW-HA組子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)與對照組相比未見明顯差異（P＞0.05）。在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的實驗中，TGFβ1組的纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)明顯高于對照組（P＜0.05），TGFβ1+HA組的纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)明顯低于TGFβ1組（P＜0.05），TGFβ1+HA+Anti-CD44 Antibody組纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)明顯高于TGFβ1+HA組（P＜0.05）。各組細(xì)胞中smad2蛋白的表達(dá)量并未發(fā)生明顯變化

10、，而TGFβ1組的smad2蛋白磷酸化水平高于對照組，TGFβ1+HA組smad2蛋白磷酸化水平低于TGFβ1組，TGFβ1+HA+Anti-CD44 Antibody組smad2蛋白磷酸化水平高于TGFβ1+HA組。
　　結(jié)論：
　　HMW-H A具有抑制子宮內(nèi)膜纖維化的作用，而LMW-HA沒有類似作用。HA與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞CD44的結(jié)合，抑制了TGFβ1/Smad2通路，使smad2蛋白磷酸化水平下降，從而抑制了纖維化

11、相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　第四部分HA/PLGA膜的制備及性質(zhì)鑒定
　　目的：
　　制備HA/PLGA膜，并對膜的表面特征、體內(nèi)外降解情況、抗變形能力、藥物釋放能力、細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測。
　　方法：
　　根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法制備PLGA膜及 HA/PLGA膜。運用掃描電鏡對PLGA膜的表面特征進(jìn)行觀察。將PLGA膜浸泡于模擬宮腔液中及放置入子宮內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)外降解實驗。運用拉伸實驗測量不同單體比例PLGA的抗變形能力，

12、并在離體子宮標(biāo)本上進(jìn)行 HA/PLGA膜通過宮頸管的變形能力觀察。運用體外藥物釋放系統(tǒng)和硫酸咔唑法對HA/PLGA膜中HA的體外釋放能力進(jìn)行檢測。運用細(xì)胞毒性體外實驗和MTT法對HA/PLGA膜浸提液的毒性進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　不同單位比例的PLGA膜的表面特征無明顯差異。不同單體比例的PLGA體外降解時間不同，PLGA(50：50)的降解速度最快，在4周時絕大部分發(fā)生降解，PLGA(90：10)降解速度最慢，在12周

13、時大部分未降解，PLGA(75:25)降解速度介于前兩者之間。體內(nèi)降解實驗發(fā)現(xiàn)PLGA(75:25)、PLGA(90：10)、HA/PLGA在宮腔內(nèi)滯留時間均能達(dá)到7天以上。隨著PLGA中LA比例的增加，其彈性模量增加，抗變形能力減弱。HA/PLGA彈性模量明顯降解，具有良好的抗變形能力，通過宮頸管后未發(fā)生明顯的膜碎裂。透明質(zhì)酸能夠在體外進(jìn)行緩慢釋放，于第4周時HA釋放量達(dá)到64.51％。HA/P LG A膜浸提液對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的毒性作

14、用與陰性對照組相當(dāng)，明顯低于陽性對照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　不同單位比例的PLGA膜的表面特征無明顯差異，選擇PLGA(75:25)作為HA的載體。HA/PLGA膜具有良好的抗變形能力，能夠通過宮頸管而不發(fā)生膜碎裂。透明質(zhì)酸能夠在體外進(jìn)行緩慢釋放。HA/PLGA膜浸提液對子宮內(nèi)膜細(xì)胞毒性較小。
　　第五部分HA/PLGA膜預(yù)防宮腔粘連作用的研究
　　目的：
　　觀察 HA/PLGA膜對宮腔粘連

15、動物模型子宮內(nèi)膜纖維化水平的影響。
　　方法：
　　運用Masson染色的方法對對照組、PLGA組、HA/PLGA組子宮內(nèi)膜纖維化程度進(jìn)行檢測。用IHC和Western Blot的方法檢測對照組、PLGA組、HA/PLGA組子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　HA/PLGA組子宮內(nèi)膜纖維化水平明顯低于對照組（P<0.05），HA/PLGA組子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平低于對照組。而PLG