轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44和AtMYB15在擬南芥防衛(wèi)反應(yīng)中的功能研究.pdf

1、當(dāng)植物受到環(huán)境中生物和非生物脅迫時(shí)，植物通過(guò)其信號(hào)傳導(dǎo)途徑有效地調(diào)控體內(nèi)相關(guān)功能基因的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)一系列生理、生化反應(yīng)，形成高效有序的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以降低或消除給植株帶來(lái)的危害．轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起著承上啟下的作用．作為植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫過(guò)程中起著重要的作用。以往研究證明，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44和AtMYB15在抗旱、抗鹽脅迫等非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是在生物脅

2、迫過(guò)程中參與了哪個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑、發(fā)揮了什么樣的作用還沒(méi)有報(bào)道。本博士論文著重通過(guò)一系列的生物化學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法，解析在多種生物脅迫過(guò)程中，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44和AtMYB15植物防衛(wèi)反應(yīng)中的作用．
　　 1AtMYB44防衛(wèi)大白菜軟腐病菌機(jī)制的研究
　　 在擬南芥中，茉莉酸（jasmonic acid, JA）和胡蘿卜軟腐歐文氏茵胡蘿卜亞種（Erwinia carotovora subsp．caroto

3、vora，Ecc）可以誘導(dǎo)AtMYB44的表達(dá)，這說(shuō)明AtMYB44可能參與了擬南芥防衛(wèi)Ecc的過(guò)程．為了研究AtMYB44在擬南芥防衛(wèi)Ecc過(guò)程中所起的作用，我們實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生了過(guò)表達(dá)AtMYB44的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（35S-M-1，并從擬南芥生物資源中心（The Arabidopsis Information Resource，TAIR）訂購(gòu)了AtMYB44 T-DNA插入突變體（atmyb44）．有報(bào)道，根部潛伏對(duì)Ecc致病作用是非常

4、關(guān)鍵的．我們從根部接種Ecc，然后利用熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察軟腐病菌在擬南芥根部的吸附。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與野生型( Col-O)相比，Ecc在atmyb44根表吸附的菌量比較少，而35S-M-1菌量較多．我們?cè)谌~片接種Ecc三天后，發(fā)現(xiàn)atmyb44葉片帶菌量比Col-0少，且發(fā)病癥狀較Col-0輕．然而在35S-M-1中，菌量顯著增加并且發(fā)病較Col重．最后，我們檢測(cè)了Col-O、35S-M-I和atmyb44中防衛(wèi)基因的表達(dá)．結(jié)果表明，

5、與Col-0相比，atmyb44中幾個(gè)JA通路基因表達(dá)增強(qiáng)，而在35S-M-1中表達(dá)下降．綜上，我們證明：AtMYB44抑制JA通路信號(hào)傳導(dǎo)，并負(fù)調(diào)控?cái)M南芥對(duì)Ecc的抗病性．
　　 2 AtMYB44作用于EIN2調(diào)控?cái)M南芥對(duì)綠桃蚜防衛(wèi)反應(yīng)
　　 蛋白質(zhì)激發(fā)子HrpNEa是植物病原細(xì)菌梨火疫病菌（Erwinia amylovora）產(chǎn)生的一種Ⅲ型效應(yīng)因子，能夠啟動(dòng)植物多個(gè)信號(hào)通路，并且能夠激活大量轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)．HrpN

6、Ea處理擬南芥能誘導(dǎo)乙烯(ethylene，ET)產(chǎn)生，乙烯信號(hào)通路在擬南芥對(duì)綠桃蚜防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，而EIN2是ET通路信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵因子．為了研究在擬南芥對(duì)綠桃蚜防衛(wèi)反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄因子的作用，我們從基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選了37個(gè)受到乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，然后使用HrpNEa處理野生型植株(Col-0)并分析它們的表達(dá)情況．結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)有22個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)，還有9個(gè)變化不顯著，其中AtMYB44的上調(diào)最

7、明顯。為了證明AtMYB44參與了調(diào)控植物對(duì)綠桃蚜（green peach aphid, GPA，Myzus persicae）的抗性，我們使用綠桃蚜接種atmyb44。結(jié)果表明：與Col-0相比，atmyb44對(duì)綠桃蚜更敏感。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EIN2的表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44的存在，而且綠桃蚜能夠誘導(dǎo)AtMYB44的表達(dá)。最后，我們通過(guò)蛋白凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic mobility shift assay，E

8、MSA）發(fā)現(xiàn)AtMYB44能夠結(jié)合EIN2啟動(dòng)子．綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)：AtMYB44通過(guò)作用于EIN2進(jìn)而調(diào)控乙烯信號(hào)通路，誘導(dǎo)擬南芥對(duì)綠桃蚜的抗蟲(chóng)性．
　　 3 AtMYB15防衛(wèi)丁香假單胞茵機(jī)制的研究
　　 當(dāng)植物受到病原菌侵染或被病原物激發(fā)子刺激后，植物能夠激活自身防衛(wèi)反應(yīng)。這一過(guò)程中涉及大量的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子在其中發(fā)揮了非常重要的作用．在擬南芥上，我們研究了轉(zhuǎn)錄因子AtMYB15在防衛(wèi)丁香假單胞茵（Pseu

9、domonas syringaepv. tomato DC3000，Pst DC3000）過(guò)程中的功能AtMYB15是一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，能夠被茉莉酸和脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)．我們使用農(nóng)桿菌侵染洋蔥表皮細(xì)胞的方法發(fā)現(xiàn)，AtMYB15定位于細(xì)胞核。在酵母細(xì)胞中，AtMYB15能夠激活酵母報(bào)告基因lacZ表達(dá)，這表明：AtMYB15具有轉(zhuǎn)錄激活活性．為了進(jìn)一步研究AtMYB15的功能，我們從TAIR訂購(gòu)AtMYBI5 T-DNA插入突變體

10、（atmyb15）．我們?cè)跀M南芥上接種Pst DC3000發(fā)現(xiàn)：與野生型相比，atmyb15更抗?。ㄟ^(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：在擬南芥上接種Pst DC3000后，atmyb15中防衛(wèi)基因PR-I、PDFl.2表達(dá)比Col-0增強(qiáng)．基于以上實(shí)驗(yàn)：AtMYB15負(fù)調(diào)控?cái)M南芥對(duì)Pst DC3000的防衛(wèi)反應(yīng)．
　　 總結(jié)
　　 本研究以擬南芥為主要研究材料，對(duì)AtMYB44和AtMYB15在幾種病原物致病過(guò)程中參與的植物防