恩施高富硒植物碎米薺含硒多糖研究.pdf

1、湖北恩施州高山地區(qū)生長(zhǎng)著一種高富硒植物——碎米薺(Cardamine)。該植物不僅硒含量高，而且是一種藥食兩用植物。為了開(kāi)發(fā)利用碎米薺植物資源，本文以湖北恩施碎米薺干制粉末為原料，選擇含硒多糖為研究切入點(diǎn)，對(duì)碎米薺含硒多糖的分離純化特性進(jìn)行了系統(tǒng)探討，為碎米薺植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論和實(shí)踐依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1. 碎米薺多糖定量測(cè)定方法的評(píng)價(jià) 根據(jù)檢測(cè)方法的重現(xiàn)性、精密度、回收率和穩(wěn)定性等指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的可行

2、性，定量測(cè)定碎米薺多糖可以采用苯酚-硫酸比色法。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，組成碎米薺多糖的單糖殘基以吡喃糖為主。 2. 碎米薺粗多糖的浸提特性 為探討碎米薺粗多糖的浸提特性，以1g碎米薺干粉為試驗(yàn)材料，選擇蒸餾水為浸提劑，首先研究浸提溫度、浸提時(shí)間、浸取劑用量、提取次數(shù)和浸提液pH值等單因素對(duì)碎米薺粗多糖提取量的影響規(guī)律，然后設(shè)計(jì)四元二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方案研究多因素對(duì)碎米薺粗多糖提取量的綜合影響。結(jié)果表明，浸提溫度、浸提時(shí)間、浸取劑用

3、量、提取次數(shù)和浸提液pH值等單因素對(duì)碎米薺粗多糖提取量有顯著影響；浸提溫度90℃、浸提時(shí)間3 h、浸取劑用量30 ml、提取次數(shù)5次和浸提液pH值為9是碎米薺粗多糖適宜的提取條件，粗多糖提取量達(dá)到4．76％。 3. 乙醇沉淀碎米薺粗多糖的規(guī)律 為探討乙醇沉淀碎米薺粗多糖的特點(diǎn)，首先考察乙醇濃度對(duì)多糖沉淀量的影響，然后研究乙醇沉淀次數(shù)對(duì)多糖沉淀量的影響。結(jié)果表明，90％(V/V)的乙醇濃度是碎米薺粗多糖的最佳沉淀濃度；用9

4、0％的乙醇對(duì)沉淀的碎米薺粗多糖經(jīng)蒸餾水溶解后再沉淀一次，不但可以最大程度地將碎米薺粗多糖提取液中的多糖沉淀出來(lái)，而且沉淀的碎米薺粗多糖得到了一定程度的純化，有利于后續(xù)粗多糖分離純化過(guò)程的進(jìn)行。 4. 碎米薺多糖共沉淀物的分離純化方法 乙醇在沉淀碎米薺粗多糖提取液中的多糖時(shí)，有一種未知化合物與多糖一起被沉淀，為了將多糖共沉淀物與多糖分離，首先用磷酸氫二鈉絮凝粗多糖提取液。離心后，收集沉淀，上清液加入磷酸氫二鈉絮凝共沉淀物，

5、反復(fù)上述操作到上清液加入磷酸氫二鈉無(wú)絮凝現(xiàn)象，合并沉淀，將沉淀用適量的蒸餾水溶解。向溶液中加入丙酮，丙酮沉淀的多糖與共沉淀物再用蒸餾水溶解，溶液用磷酸氫二鈉絮凝沉淀，離心后，沉淀經(jīng)蒸餾水溶解用磷酸氫二鈉絮凝，如此反復(fù)將沉淀溶解、丙酮沉淀、磷酸氫二鈉絮凝，直到共沉淀物經(jīng)硫酸-苯酚法檢測(cè)呈陰性為止。然后用大孔樹(shù)脂吸附層析對(duì)共沉淀物進(jìn)行分離純化，層析條件是：一定濃度的樣品40 ml上柱，以流速1.2 ml/min進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，再用濃度30％-

6、80％的甲醇以流速2.5 ml/min通過(guò)樹(shù)脂床進(jìn)行梯度洗脫；最后用瓊脂糖(Sepharose)6B(20×400mm)凝膠過(guò)濾層析將共沉淀物進(jìn)一步純化，層析條件是：上樣量3 ml，蒸餾水洗脫，控制洗脫流速為1.5 ml/min。 5. 共沉淀物純度鑒定及其結(jié)構(gòu)表征 純化的共沉淀物用高效液相色譜法進(jìn)行純度鑒定，用質(zhì)譜法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明共沉淀物為高效液相色譜純，是一種以連接有羥基的五元環(huán)和六元環(huán)烷烴為母核，母核之

7、間有羧酸酯鍵的大分子化合物。 6. 碎米薺共沉淀物的絮凝規(guī)律 為探討碎米薺共沉淀物的絮凝特性，選擇磷酸氫二鈉和氫氧化鈣為絮凝試劑，通過(guò)磷酸氫二鈉和氫氧化鈣用量、pH值等單個(gè)因素對(duì)共沉淀物絮凝量影響的研究及其上述兩個(gè)因素對(duì)共沉淀物絮凝量綜合影響的研究，發(fā)現(xiàn)影響共沉淀物絮凝量的因素是堿性的絮凝體系和金屬離子的存在，堿性條件對(duì)共沉淀物絮凝量的影響比金屬離子大。 7. 碎米薺粗多糖的色素共存特性 色素與碎米薺粗多

8、糖共存時(shí)，為了研究碎米薺色素在粗多糖溶液中被脫除的基本特性，以活性炭為吸附劑，在脫色溫度、脫色時(shí)間與活性炭用量等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了三因素三水平的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，上述單因素對(duì)碎米薺色素的脫除有顯著影響，并得到脫除碎米薺粗多糖色素的適宜條件為脫色溫度80℃，脫色時(shí)間4 h，活性炭用量0.8％。為盡量減少粗多糖被活性炭吸附造成的損失，以蒸餾水為解吸劑，選擇解吸溫度、解吸時(shí)間及解吸劑用量為試驗(yàn)因素進(jìn)行九水平均勻試驗(yàn)，用

9、回歸分析對(duì)其試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)碎米薺色素與多糖之間以非結(jié)合態(tài)形式共同存在粗多糖溶液中，并得出解吸粗多糖的適宜條件為解吸時(shí)間100 min，解吸溫度78℃，蒸餾水用量為活性炭的10倍，可有效解吸粗多糖，減少粗多糖的損失。 8. 碎米薺粗多糖的蛋白質(zhì)共存特性 蛋白質(zhì)與碎米薺粗多糖共存時(shí)，為了研究蛋白質(zhì)在粗多糖溶液中被脫除的基本特性，以三氯乙酸為脫除碎米薺粗多糖溶液中蛋白質(zhì)的試劑，進(jìn)行了三氯乙酸濃度、脫除溫度和脫除時(shí)間等單

10、因素試驗(yàn)和三氯乙酸濃度和處理時(shí)間二因素九水平均勻試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差和回歸分析發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)蛋白質(zhì)脫除沒(méi)有影響，三氯乙酸濃度和脫除時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)脫除的影響存在顯著關(guān)系，并得到脫蛋白的適宜條件：室溫下，選擇4％的三氯乙酸濃度，脫除時(shí)間12-16h。 9. 碎米薺含硒多糖的純化方法 首先采用纖維素陰離子(DEAE-52)柱層析將中性和酸性含硒多糖分開(kāi)，然后用葡聚糖G-100凝膠柱層析將中性含硒多糖和酸性含硒多糖進(jìn)行純化，分別得到

11、一個(gè)中性含硒多糖組分和兩個(gè)酸性含硒多糖組分。高效液相色譜法鑒定中性含硒多糖(Se-P Ⅰ)的純度為色譜純，含量較大的酸性含硒多糖(Se-PⅡ)組分鑒定出兩個(gè)組分，其中一個(gè)組分為含硒多糖，另一個(gè)為未知組分。 10. 碎米薺含硒多糖Se-PⅠ的結(jié)構(gòu)表征 采用化學(xué)法、氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、紅外光譜以及核磁共振等現(xiàn)代分析方法對(duì)純化的碎米薺含硒多糖Se-PⅠ結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究，研究結(jié)果表明，碎米薺含硒多糖Se-PⅠ是一種含