蛋白磷酸酶活性測定及其凝膠電泳檢測方法的改進.pdf

1、蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化在生物體中起著很重要的生理生化作用，對去磷酸化酶的研究目前主要是從磷酸酯酶的研究轉(zhuǎn)向蛋白磷酸酶(protein phosphatase)的研究。迄今為止，只有少數(shù)的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶被報道?，F(xiàn)在蛋白磷酸酶研究直接面臨著瓶頸——缺乏一種簡便易行、特異快速的檢測方法，造成了該領域研究的困難。 本研究中用蛋白磷酸酶的天然底物——酪蛋白作為檢測反應底物，通過鉬藍比色法測定反應后生成的無機磷酸根含量，建立了一

2、種基于蛋白底物的蛋白磷酸酶活力測定新方法，在測定中分析了去除底物蛋白的方法對顯色的影響，并篩選出TCA、超濾等方法去除底物蛋白以免干擾后續(xù)顯色檢測，從而優(yōu)化了測定條件。該方法具有成本低、背景噪音小、操作簡單、快速靈敏的特點。 結(jié)果表明，蛋白磷酸酶活性測定可采用如下方法：500μL反應體系中(緩沖液由酶而定)，包含0.2mM底物酪蛋白，加入具有蛋白磷酸酶活性樣品，37℃水浴反應10min。再加TCA終止反應、沉淀蛋白(使其終濃度為

3、5％)，離心10,000rmp×15min去除沉淀。或直接將反應溶液超濾7,000rpm×50min。取上清，加入鉬藍顯色液(加入量占總體積的1/10)，37℃水浴反應1h，在700nm波長下測定吸收值。 為了方便后續(xù)分離、快速鑒定及分析蛋白磷酸酶，有必要開發(fā)一種通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、分析同工酶譜帶的簡便、快速、特異、靈敏的方法。本實驗室從磷酸蛋白酶的底物出發(fā)，建立了一種蛋白磷酸同功酶的電泳分析方法。它是將偶聯(lián)有底物酪蛋白