燒傷后一氧化氮促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本課題重點(diǎn)探討了NO通過cGMP\PKG\Rho GTPase途徑調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞骨架的重排，進(jìn)而促進(jìn)ESCs遷移;以及在體NO通過增強(qiáng)表皮干細(xì)胞遷移而促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化，最終修復(fù)創(chuàng)面。
　　一、燒傷后創(chuàng)面NO的產(chǎn)生:為進(jìn)一步了解燒傷患者創(chuàng)面中NO濃度及燒傷不同時(shí)間點(diǎn)NO濃度的變化，共收集臨床20例燒傷患者標(biāo)本，其中水泡液46份，血清27份;深二度燒傷創(chuàng)面組織14份，同體正常皮膚組織14份。均符合入選標(biāo)準(zhǔn):年齡18-55，性別不限，燒

2、傷面積≤40％TBSA。收集水泡液、血清及組織塊-80度保存。
　　1、水泡液及血清中NO濃度檢測(cè):采用Griess Reagent法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小面積(燒傷面積≤40％TBSA)患者血漿中NO的濃度相對(duì)恒定在6.44±0.71μM;而燒傷患者水泡液中NO隨傷后不同時(shí)間而有較大變化，傷后10小時(shí)內(nèi)的水泡液NO濃度為7.73±0.62μM，傷后10至20小時(shí)水泡液NO濃度為9.45±0.65μM，傷后20至30小時(shí)水泡液NO濃度為7.

3、23±1.53μM，傷后30小時(shí)以上時(shí)水泡液NO濃度為6.84±1.08μM，發(fā)現(xiàn)在傷后10至20小時(shí)時(shí)水泡液NO濃度最高。
　　2、燒傷創(chuàng)面中NO濃度的測(cè)定:組織塊碾磨后用同體積去離子水混合離心取上清。結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常組織中NO濃度為0.32±0.13μM，淺二度創(chuàng)面組織中NO濃度為4.70±0.70μM。表明燒傷后創(chuàng)面組織中NO濃度較正常組織中NO濃度高出約15倍。
　　3、深二度燒傷創(chuàng)面組織中iNOS的表達(dá):燒傷患者正常

4、組織及淺二度組織經(jīng)石蠟包埋、切片后行免疫熒光組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)，正常組織中iNOS表達(dá)不明顯，而創(chuàng)面組織中在表皮的基底層及真皮組織中iNOS明顯，其中表皮基底層iNOS的表達(dá)與表皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物角質(zhì)蛋白CK19存在共定位。表明，燒傷后表皮干細(xì)胞中高表達(dá)iNOS。
　　4、深二度燒傷創(chuàng)面組織及正常組織中iNOS蛋白的表達(dá):燒傷患者正常組織及淺二度組織經(jīng)組織蛋白性蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面組織中NO濃度較正常組織中NO濃度高出14.8倍，表明

5、燒傷后表皮組織高表達(dá)iNOS。
　　二、原代人表皮干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:主要是進(jìn)行表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及細(xì)胞免疫化學(xué)、克隆實(shí)驗(yàn)和流式等鑒定手段，我們發(fā)現(xiàn):Ⅳ型膠原10min快速黏附法可以快捷、方便的實(shí)現(xiàn)表皮干細(xì)胞分離富集，能較好的維持表皮干細(xì)胞的干性。
　　三、NO對(duì)表皮干細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制研究:
　?。ㄒ唬㎞O對(duì)培養(yǎng)表皮干細(xì)胞遷移的影響:我們首先進(jìn)行了NO供體SNAP不同作用時(shí)間產(chǎn)生NO濃度和SNAP對(duì)表皮干細(xì)

6、胞的毒性檢測(cè);通過劃痕實(shí)驗(yàn)和活性工作站完成NO對(duì)表皮干細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)速度的檢測(cè)，以及通過細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)和pull down技術(shù)檢測(cè)NO促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移可能的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　?。ǘ㎞O對(duì)培養(yǎng)表皮干細(xì)胞遷移的機(jī)制研究:cGMP-PKG是NO最重要的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為此我們通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)、Pull-down實(shí)驗(yàn)，分別分組給予cGMP抑制劑ODQ、PKG抑制劑Rp-8pcpt-cGMPs、Rho A抑制

7、劑Rhosin、Cdc42抑制劑ZCL278、Rac1抑制劑Z62954982及SNAP處理，此外還采用Rho A、Rac1、Cdc42的特異性小干擾RNA驗(yàn)證“NO通過cGMP-PKG調(diào)節(jié)活化Rho GTPase，進(jìn)而影響細(xì)胞骨架蛋白F-actin的聚合，最終促進(jìn)ESCs遷移”的假說。
　　1、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cGMP\PKG\Rho GTPase信號(hào)通路在NO促進(jìn)ESCs遷移中的作用，結(jié)果表明，SNAP對(duì)ESCs細(xì)胞的遷移作用可被

8、cGMP、PKG、RhoA、Rac1抑制劑阻斷，其中Rho A抑制劑的抑制作用最顯著，而Cdc42抑制劑的阻斷作用不明顯。
　　2、活細(xì)胞工作站實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cGMP\PKG\Rho GTPase信號(hào)通路在NO促進(jìn)ESCs運(yùn)動(dòng)速度的作用，結(jié)果表明:NO供體SNAP促進(jìn)ESCs細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，其作用可被cGMP、PKG、RhoA、Rac1抑制劑阻斷，其中Rho A抑制劑的抑制作用顯著，而Cdc42抑制劑阻斷SNAP對(duì)ESCs運(yùn)動(dòng)速度的影響弱。

9、
　　3、激光共聚焦檢測(cè)cGMP\PKG\Rho GTPase信號(hào)通路在NO對(duì)ESCs細(xì)胞骨架蛋白F-actin聚合中的作用:我們采用imageJ分析了皮層肌動(dòng)蛋白(cortical actin)和絲狀偽足(filopodia)觀察細(xì)胞骨架蛋白F-actin的聚合情況。
　　4、Pull-down技術(shù)檢測(cè)cGMP\PKG在NO活化Rho GTPase中的作用:采用Pull-down技術(shù)檢測(cè)NO供體SNAP處理表皮干細(xì)胞24小

10、時(shí)對(duì)RhoA，Cdc42和Rac1的活化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)RhoA活化作用以對(duì)照組設(shè)為1，SNAP組為4.46±0.14; ODQ+ SNAP組為0.89±0.11;Rp-8pcpt-cGMPs+SNAP組為1.52±0.12;對(duì)Rac1活化作用SNAP組為2.08±0.08，ODQ+SNAP組為0.72±0.12，Rp-8pcpt-cGMPs+SNAP組為1.22±0.17;對(duì)Cdc42活化作用SNAP組為1.16±0.24，ODQ+SN

11、AP組為1.21±0.13;Rp-8pcpt-cGMPs+SNAP組為0.89±0.13。表明NO通過cGMP、PKG調(diào)節(jié)Rho A，Rac1的活化作用。
　　5、Pull-down技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間SNAP對(duì)活化RhoA的作用:采用Pull down技術(shù)檢測(cè)SNAP在處理后6、12、18、24小時(shí)對(duì)RhoA，Cdc42和Rac1的活化作用。表明在給予SNAP處理后ESCs中活化的Rho GTPase持續(xù)高表達(dá)。
　　6、si

12、RNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞及siRNA干擾效率檢測(cè):50 nM的siRNA采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞，以與Rho GTPase無同源性的葡萄糖氧化酶GLO的siRNA作為陰性對(duì)照，為避免脫靶效應(yīng)每一個(gè)mRNA均采用兩個(gè)不同的siRNA。采用WB檢測(cè)siRNA的干擾效率均大于75％。
　　同時(shí)我們采用RhoA、Rac1和Cdc42的特異性siRNA干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了NO通過Rho GTPase的RhoA和Rac1在NO促

13、進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移中的作用。
　　7、siRNA干擾后檢測(cè)Rho GTPase在NO促進(jìn)ESCs遷移中的作用:采用RhoGTPase的特異性siRNA干擾目的基因的表達(dá)后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，表明，NO通過Rho GTPase的Rho A和Rac1影響表皮干細(xì)胞的遷移作用。
　　8、siRNA干擾后檢測(cè)Rho GTPase在NO促進(jìn)ESCs運(yùn)動(dòng)中的作用:采用RhoGTPase的特異性siRNA干擾目的基因的表達(dá)后進(jìn)行活性工作檢測(cè)細(xì)胞的

14、運(yùn)動(dòng)速度實(shí)驗(yàn)，表明RhoA siRNA、Rac1 siRNA可阻斷NO對(duì)ESC運(yùn)動(dòng)速度的促進(jìn)作用。
　　9、siRNA干擾后檢測(cè)Rho GTPase在NO促進(jìn)骨架蛋白F-actin聚合中的作用:采用Rho GTPase的特異性siRNA干擾目的基因的表達(dá)后給予NO供體SNAP處理24小時(shí)。通過imageJ分析了皮層肌動(dòng)蛋白(cortical actin)和絲狀偽足(filopodia)的表達(dá)觀察細(xì)胞骨架蛋白F-actin的聚合與重

15、排作用。研究表明，Rho GTPase的Rho A、Rac1的mRNA干擾小RNA可阻斷SNAP對(duì)ESCs的F-actin的聚合作用。
　　四、NO對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合及在體表皮干細(xì)胞遷移的影響:為進(jìn)一步探討NO在創(chuàng)面愈合、上皮化以及進(jìn)一步驗(yàn)證NO對(duì)ESC的在體遷移情況，我們?cè)贐rdU在體標(biāo)記表皮干細(xì)胞基礎(chǔ)上采用全層皮膚缺損模型研究NO在創(chuàng)面愈合、上皮化以及對(duì)ESC遷移。應(yīng)用BrdU在體標(biāo)記表皮干細(xì)胞后孔器器打孔，傷口大小為直徑4.5m

16、m，分組分別給予腹腔注射生理鹽水組，甘氨酸(Gly)，一氧化氮合成底物(L-精氨酸)及一氧化氮合酶抑制劑(L-NMMA)。分別于傷后0、1、3、5、7、9天觀察創(chuàng)面愈合情況，于第9天取材做HE染色觀察創(chuàng)面上皮化情況，于第12天觀察ESC遷移情況。
　　總結(jié):
　　1、燒傷后表皮干細(xì)胞可能通過高表達(dá)iNOS，而促進(jìn)燒傷創(chuàng)面NO的大量產(chǎn)生;
　　2、Ⅳ型膠原快速黏附結(jié)合K-SFM角質(zhì)細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單、快捷

17、、有效分離、純化人表皮干細(xì)胞的方法;
　　3、NO供體SNAP對(duì)體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞的最佳作用濃度為100μM。
　　4、NO通過cGMP/PKG調(diào)節(jié)Rho GTPase的Rho A和Rac1的活化影響細(xì)胞骨架蛋白F-actin的聚合，進(jìn)而促使表皮干細(xì)胞遷移，最終促進(jìn)創(chuàng)面愈合。
　　5、在體實(shí)驗(yàn)中，NO可能通過促進(jìn)表皮干細(xì)胞遷移，而促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化，最終促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。
　　綜上所述，燒傷后創(chuàng)面表皮干細(xì)胞可能通