一氧化氮對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞-前體細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的：通過(guò)減少內(nèi)源性一氧化氮(nitric oxide，NO)或者增加外源性NO的方式，探討NO對(duì)體外培養(yǎng)狀態(tài)下的新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞(neural stem cells/neuralprecursors，NSCs/NPs)分化的作用。 方法： 1．采用常規(guī)方法分離新生大鼠腦室下帶(subventricular zone，SVZ)組織，進(jìn)行NSCs/NPs體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，并添加5．溴．2-脫氧尿嘧啶核苷(5-

2、bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記增殖的細(xì)胞。 2．用N-硝基-L精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME)作為神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)抑制劑，觀察內(nèi)源性NO的減少對(duì)NSCs/NPs分化的影響。 3．用二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(diethylenetriamine/NO，DETA

3、/NO)作為外源性NO供體，觀察外源性NO的增加對(duì)NSCs/NPs分化的影響。 4．用免疫細(xì)胞化學(xué)方法，觀察NSCs/NPs標(biāo)志物——巢蛋白(neuroepthelial stemcell protein，nestin)、神經(jīng)元標(biāo)志物——βⅢ型微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin，Tuj-1)和星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物——膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表達(dá)；觀察BrdU和

4、nNOS表達(dá)情況。 5．用Greiss還原法檢測(cè)培養(yǎng)液中總NO的濃度。 結(jié)果： 1．從SVZ分離的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)5-7天體外培養(yǎng)，可形成神經(jīng)球。原代或次代培養(yǎng)的神經(jīng)球均為nestin陽(yáng)性，同時(shí)可檢測(cè)到BrdU陽(yáng)性的細(xì)胞。在不施加任何處理因素的情況下，原代或次代神經(jīng)球均可分化出Tuj-1陽(yáng)性的神經(jīng)元和GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2．在體外培養(yǎng)的NSCs/NPs中加入L-NAME 5天后，100μM、1

5、50μM、200μML-NAME實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中NO濃度分別為28.4±3.0μM、27.9±2.7μM、25.2±4.4μM，較對(duì)照組(34.1±2.7μM)減少(P<0.05)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組分化的神經(jīng)元數(shù)分別為34.5±5.2％、33.8±5.7％、32.6±7.2％，較對(duì)照組(40.8±6.7％)減少(P<0.05)；150μM、200μM實(shí)驗(yàn)組分化的星型膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)分別為27.5±4.1％、27.0±7.5％，較對(duì)照組(36.2±4.3

6、％)也減少(P<0.05)。另外，100μM、150μM、200μM L-NAME實(shí)驗(yàn)組分化細(xì)胞表達(dá)的nNOS陽(yáng)性率分別為19.0±5.3％、18.0±3.0％、17.8±4.9％，也較對(duì)照組(25.9±6.4％)減少(P<0.05)。 3.在體外培養(yǎng)的NSCs/NPs加入DETA/NO 5天后，40μM、50μM、60μMDETA/NO實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中分別釋放出62.0±6.4μM、64.8±15.7μM、68.5±11.6