α-酮戊二酸脫氫酶基因在嗜酸性氧化硫硫桿菌中的表達(dá)研究.pdf

1、嗜酸性氧化硫硫桿菌廣泛用于生物冶金、煤的脫硫和含硫廢水及垃圾的處理。酶學(xué)分析表明，嗜酸性氧化硫硫桿菌缺乏TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶α-酮戊二酸脫氫酶等，不能單純通過TCA循環(huán)氧化碳水化合物獲得能量，其不完全的TCA循環(huán)僅提供中間產(chǎn)物參與合成細(xì)胞的部分碳架。這類細(xì)菌的自養(yǎng)生活方式?jīng)Q定了這些細(xì)菌生長緩慢、代時長、細(xì)胞得率低。這不僅限制了嗜酸性氧化硫硫桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用，也給生化檢測、蛋白質(zhì)和酶的分離及DNA的提取等帶來困難。要從根本上解決這一問題

2、需要用遺傳學(xué)的方法對菌種進(jìn)行改良，使其生長代謝適合于實(shí)際應(yīng)用的要求。 本文的目的是將克隆的異養(yǎng)性大腸桿菌α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體基因sueAB與lpdA導(dǎo)入專性自養(yǎng)極端嗜酸性氧化硫硫桿菌中表達(dá)，獲得可以表達(dá)α-酮戊二酸脫氫酶活性，并能夠利用有機(jī)質(zhì)快速生長的嗜酸性氧化硫硫桿菌工程菌，并進(jìn)一步研究有機(jī)質(zhì)對基因工程菌生長的影響機(jī)制以及工程菌對有機(jī)質(zhì)的利用情況等。為改造這類細(xì)菌并應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論和方法。 實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)以

3、E.coli K12菌株基因組DNA作為模板，利用PCR方法擴(kuò)增得到大腸桿菌α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體sucAB與lpdA全基因序列，并連接到質(zhì)粒puC18載體中。在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)行了如下研究： 把大腸桿菌α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體sucAB與lpdA基因從pUC18上亞克隆到具有廣泛寄主范圍的質(zhì)粒pJRD215上，構(gòu)建了含大腸桿菌α-酮戊二酸脫氫酶基因的重組質(zhì)粒pJRD215-sucAB-lpdA。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pJRD21

4、5-sucAB-lpdA所攜帶的sucAB與lpdA基因基因能夠在大腸桿菌中表達(dá)出具有活性的酶蛋白，而且保留了載體上原有的Km和Sm抗性。 將重組質(zhì)粒pJRD215-sucAB-lpdA引入整合有tra基因的E.coli SM10中，以E.coli SM10(pJRD215-sucAB-lpdA)作為供體菌，野生型Acidithiobacillus thiooxidans ATCC19377作為受體菌在濾膜上進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒p

5、JRD215-sucAB-lpdA在tra基因的作用下以較高的頻率(2.4×10-6)從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到了A.thiooxidans ATCC19377菌株中，并通過質(zhì)粒提取及菌落PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。酶活性測定表明，在對照野生型菌株的細(xì)胞提取液中未檢測到α-酮戊二酸脫氫酶活性，而含有重組質(zhì)粒的嗜酸性氧化硫硫桿菌細(xì)胞提取液中可檢測到。這表明，大腸桿菌的啟動子可以被嗜酸性氧化硫硫桿菌的RaNA聚合酶識別并啟動轉(zhuǎn)錄，α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體基因能

6、夠表達(dá)出具有活性的酶，因而推測極端嗜酸性硫桿菌在基因表達(dá)機(jī)制方面與異養(yǎng)性大腸桿菌可能存在相似之處。利用RT-PCR的方法從轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因的轉(zhuǎn)錄，證明野生型嗜酸性氧化硫硫桿菌存在代謝缺陷，而重組菌中可以檢測到sucAB與ιpdA基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。但是無論從蛋白水平還是酶活水平上檢測，重組菌中表達(dá)的α-酮戊二酸脫氫酶活性非常低，說明在嗜酸性氧化硫硫桿菌和大腸桿菌之間在基因表達(dá)和調(diào)控方面還存在一定差異。質(zhì)粒的穩(wěn)定性測定表明，在無選擇壓力

7、條件下連續(xù)傳代50次，質(zhì)粒在嗜酸性氧化硫硫桿菌的保存率仍可達(dá)到71％左右，說明質(zhì)粒在嗜酸性氧化硫硫桿菌中比較穩(wěn)定。 研究了氧化硫硫桿菌基因工程菌在Starkey-S0液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖、有機(jī)酸(α-酮戊二酸、檸檬酸和丙酮酸)的生長狀況。結(jié)果表明，工程菌可以更有效的利用葡萄糖。而α-酮戊二酸、檸檬酸對野生型與工程菌的生長沒有明顯影響，這可能與細(xì)胞的選擇透性有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)工程菌可以解除丙酮酸的抑制作用，說明中間代謝產(chǎn)

8、物的積累對細(xì)胞確實(shí)有毒害作用。雖然葡萄糖對嗜酸性氧化硫硫桿菌的生長有促進(jìn)作用，但在不提供硫作為能源時無法生長，說明硫桿菌不具備利用有機(jī)物產(chǎn)生ATP的電子傳遞系統(tǒng)，因而對有機(jī)物的利用有限。 本文首次將大腸桿菌α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體基因引入嗜酸性氧化硫硫桿菌中，sucAB與ιpdA基因在自身啟動子的控制下在宿主菌中獲得了表達(dá)，證明了異養(yǎng)菌中心代謝途徑的酶復(fù)合體基因(α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體)能夠在專性自養(yǎng)極端嗜酸性氧化硫硫桿菌中表