玫瑰孢鏈霉菌支鏈α酮酸脫氫酶基因功能研究.pdf

1、達托霉素已成為治療革蘭氏陽性菌感染特別是耐藥菌感染的重磅炸彈藥物，現(xiàn)已在臨床應用于革蘭氏陽性菌引起的皮膚感染和MRSA引起的心內膜炎。達托霉素是從Streptomyces roseosporus產生的脂肽類次級代謝產物A21978C混合物中分離出的最小的組分。A21978C混合物均含有一個13個氨基酸組成的母核，包含了環(huán)上10個氨基酸和環(huán)外的三個氨基酸殘基。不同的是達托霉素在結構上含有一個直鏈癸酸尾巴，其他A21978C主要的三個組分在

2、N末端分別含有11、12、13個碳原子的支鏈脂肪酸鏈。達托霉素可以通過外源添加癸酸前體提高產量。
　　支鏈脂肪酸是A21978C的重要前體，調控脂肪酸代謝途徑對于定向合成特定A21978C成分有重要的意義。支鏈脂肪酸是鏈霉菌的主要脂肪酸，其生物合成需要支鏈氨基酸通過分解代謝提供重要的支鏈CoA前體。支鏈α酮酸脫氫酶(BCDH)是一個多亞基酶復合體，是支鏈氨基酸分解代謝的關鍵酶。支鏈氨基酸通過纈氨酸脫氫酶催化得到支鏈α酮酸，并進一步

3、在BCDH的作用下，產生相應的乙酰CoA及其衍生物。通過同源比對發(fā)現(xiàn)在S.roseosporus NRRL15998中有兩個獨立的編碼BCDH的基因，然而其功能未知。
　　推測S.roseosporusNRRL15998中BCDH可能為A21978C包括達托霉素的生物合成提供前體。研究BCDH對達托霉素生物合成的影響將為代謝工程手段改造菌株提供重要理論依據(jù)。
　　目的:本文旨在研究S.roseosporus NRRL1599

4、8中編碼支鏈α酮酸脫氫酶的bkd基因對S.roseosporus生長及達托霉素生物合成的影響，為解析支鏈α酮酸脫氫酶的作用機制和改造S.roseosporus提高達托霉素產量提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.分析S.roseosporus NRRL15998基因組序列，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)參與編碼支鏈α酮酸脫氫酶(BCDH)合成的基因。為了研究bkd基因的時空表達，通過實時定量PCR檢測發(fā)酵過程中不同時間點bkd1和bkd2

5、的轉錄水平。
　　2.為了研究S.roseosporus中bkd1和bkd2基因的功能，構建bkd1和bkd2基因敲除株bkd1DM和bkd2DM。同時構建bkd1基因過表達株(OM)和遺傳互補株(CM)。通過MIDI脂肪酸檢測系統(tǒng)，測定突變株脂肪酸組分;檢測突變株對支鏈氨基酸的代謝能力。
　　3.為了研究bkd基因與A21978C生物合成的關系，發(fā)酵重組菌株，檢測達托霉素產量;此外，探討支鏈α酮酸脫氫酶在菌體對癸酸耐受中的

6、影響，測試菌株的癸酸耐受能力。
　　結果:
　　1.從S.roseosporus NRRL15998基因組中克隆出兩個bkd基因簇:bkd1和bkd2。實時熒光定量分析表明在整個發(fā)酵過程中，對比于bkd1，bkd2在S.roseosporus中基本不轉錄。
　　2.通過質粒構建和接合轉移篩選，成功構建敲除株bkd1DM和bkd2DM，遺傳回補株bkd1CM，過表達株HL06和HL08，以及對應的空載對照株HL05和HL

7、07。bkd1缺失導致S.roseosporus支鏈氨基酸代謝能力喪失，支鏈脂肪酸合成受阻，這表明Bkd1是S.roseosporus重要的支鏈α脫氫酶。
　　3.發(fā)酵產物生物活性檢測結果表明，bkd1敲除后產量降低97.8％，遺傳回補后產量得到部分恢復;將bkd2敲除后產量降低34.5％。HL06和HL08產量對比對照組分別增加了207.2％和94.8％。bkd1敲除株對癸酸壓力敏感;bkd2缺失對支鏈脂肪酸合成及癸酸耐受水平無