嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌tetH基因高效表達、敲除及工程菌性能研究.pdf

1、嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌是一種嗜酸性專性化能無機自養(yǎng)菌,是生物冶金工業(yè)中的優(yōu)勢菌種,廣泛應用于低品位貧礦的開采冶煉。該菌可以利用業(yè)鐵離子(Fe2+)、硫單質(S0)或還原性硫化合物(RISCs)為能源進行生長。其中,其鐵代謝研究已相對完善,而硫代謝由于價態(tài)的多變及非酶學反應的發(fā)生使得研究進展緩慢。連四硫酸鹽(S4O62-)是該菌元素硫代謝過程中的一個關鍵中間代謝產物,也可作為唯一能源物質,由連四硫酸鹽水解酶催化將其水解為硫酸鹽(SO42-)

2、、硫單質(S0)及硫代硫酸鹽(S2O32-)。然而對連四硫酸鹽水解酶的功能及其編碼基因tetH的研究大多集中于生物信息學預測,缺乏相應的實驗數(shù)據支持,因而將該基因進行無痕敲除,同時構建該基因的過表達工程菌,為探究該基岡的具體功能提供實驗數(shù)據支持,也為研究其它硫代謝相關基因提供方法指導。
　　由于嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的tetH基因在自身啟動子下在大腸桿菌中未見明顯表達,因此,用tac強啟動子代替其自身啟動子在大腸桿菌實現(xiàn)了異源高效表

3、達,然后亞克隆至廣范圍宿主質粒pMSD1中,構建重組質粒pMSD1-tac-tetH,并且通過接合轉移將其導入嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌中,構建了工程菌At.ferrooxidans ATCC23270(pMS1-tac-tetH)。
　　另一方而,根據基因同源重組原理,構建了對嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌連四硫酸鹽水解酶基因(tetH)進行無痕敞除的自殺質粒載體pKIT-KtetH,通過接合轉移導入嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌中,在卡那霉素抗性平板上

4、篩選獲得單交換子。之后將表達I-Scel酶的重組質粒pMSD1-I-Scel通過接合轉移導入單交換予中,在鏈霉素抗性平板上篩選獲得接合轉移予。根據二次重組后嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌野生型與tetH基因缺失突變株基因組序列的不同,設計相關引物,通過PCR方法對鏈霉素抗性平板上的單菌落進行初篩,并使用Sounhem blot雜交驗證獲得的發(fā)生第二次重組的tetH基因敲除突變株。
　　為了研究構建的tetH基因高效表達工程菌及tetH基因缺

5、失突變株硫代謝方面的性質,以嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌野生型為對照,測定了各菌株在9K-S0液體培養(yǎng)基、9K-K2S4O6液體培養(yǎng)基以及9K-FeSO4液體培養(yǎng)基中的生長,連四硫酸鹽的利用效率,連四硫酸鹽水解酶酶活以及三種培養(yǎng)條件下相關硫氧化基因轉錄水平的變化,結果表明(1)嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌tetH基因高效表達工程菌可以更好地利用硫粉或者連四硫酸鹽進行生長,并且在連四硫酸鹽培養(yǎng)基中生長相對野生型明顯提高,但生長總量不及以元素硫為能源物質時

6、的生長總量。(2)嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌tetH基因敲除突變株不能利用連四硫酸鹽進行生長,但是可以在硫粉為能源物質下進行生長,且其生長要慢于野生型菌株,證明tetH基因確實編碼連四硫酸鹽水解酶,而且是該菌唯一能夠代謝連四硫酸鹽的水解酶。tetH基因的缺失并不阻止該菌以硫粉(S0)為能源的生長代謝,分析認為可能存在繞過連四硫酸鹽產生的其他途徑。(3)在亞鐵離子為唯一能源下,tetH基因缺失突變株可以生長,且培養(yǎng)物中的Fe2+的濃度降低速率要

7、快于野生型,而tetH基因高效表達工程菌培養(yǎng)物中的Fe2+的濃度降低速率最慢,該實驗結果與連四硫酸鹽水解酶具有還原Fe3+為Fe2+的功能相符。(4)不同培養(yǎng)條件下各菌株熒光定量PCR結果表明tetH基因與doxD2基因的轉錄具有協(xié)同性,doxD2基因在硫代硫酸鹽的代謝中起關鍵作用,并且AFE0267以及AFE1792兩個sqr基因中,首次提出前者在硫化氫代謝中可能起主要作用。為了研究tetH基因缺失后對該菌整個硫代謝網絡的影響,正在利