艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑抑制肺脾癌A549細胞裸鼠移植瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及其作用機制的研究.pdf

1、目的:肺癌的發(fā)病率、死亡率均居全球惡性腫瘤首位，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占85％，五年生存率僅10％～15％，嚴重威脅人類生命健康。肺癌早期癥狀不典型，確診時多已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者生存率的重要原因。因此，發(fā)現(xiàn)新的作用靶點、尋找抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物將成為治療肺癌的突破點。
　　肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是由多因子、多信號通路參與且互相影響的復(fù)雜過程，尋找肺癌侵襲和轉(zhuǎn)

2、移特異性的生物標(biāo)志物并干預(yù)其表達是抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的有效途徑之一。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)是一類介導(dǎo)同種上皮細胞之間相互黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，調(diào)節(jié)細胞之間及細胞與基質(zhì)之間的黏附作用，在非小細胞肺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。埃茲蛋白(Ezrin)是一種膜-細胞骨架連接蛋白，與肺癌組織學(xué)類型、細胞分化程度、臨床分期無明顯相關(guān)，與淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系較為密切。與張力蛋白同源10號染色體缺失的磷酸酶基因(phosphat

3、ase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN)是第一個具有雙特異性磷酸酶活性的新型抑癌基因。研究表明，PTEN蛋白低表達或不表達肺癌患者更易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，且生存期短于高表達或陽性表達者。皮層肌動蛋白(Cortactin)是一種微絲肌動蛋白結(jié)合蛋白，通過影響腫瘤細胞運動、細胞外基質(zhì)降解、失巢凋亡、細胞黏附等不同作用機制參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Cortactin蛋白在肺癌組織高表

4、達與淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。
　　研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)在肺癌組織中高表達，與肺癌細胞增殖、凋亡、血管生成、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究表明COX-2抑制劑如塞來昔布、尼美舒利均可抑制肺癌細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制新生血管和淋巴管生成等，從而抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移。艾瑞昔布（Imrecoxib）作為新型適度選擇性COX-2抑制劑，減少高選擇性COX-2抑制劑產(chǎn)生的嚴重心血管事件。國內(nèi)外關(guān)于艾瑞昔布抑制

5、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的報道并不多見。第3代化療藥物洛鉑通過形成Pt-GG和Pt-AG鏈內(nèi)交叉連接阻礙腫瘤細胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，能明顯減輕順鉑的腎毒性，減輕奧沙利鉑的神經(jīng)毒性，具有抗瘤譜廣，腫瘤組織中濃度高而血漿中濃度低等優(yōu)勢。目前國內(nèi)外關(guān)于COX-2抑制劑聯(lián)合化療藥物是否可增強化療療效尚不明確，本研究旨在探討艾瑞昔布單藥及其聯(lián)合洛鉑對人肺癌裸鼠移植瘤的生長是否具有抑制作用，通過對E-cadherin、Ezrin、Cortactin及PTEN

6、蛋白及相應(yīng)mRNA表達的影響，探究艾瑞昔布單藥及聯(lián)合洛鉑能否抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移及其作用機制。
　　方法:
　　選取30只BALB/c雄性裸小鼠，4～5周齡，體重20～24g，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。將F12k培養(yǎng)基培養(yǎng)的處于對數(shù)期肺腺癌A549細胞制成單細胞懸液，接種于裸鼠右側(cè)腋部皮下，建立人肺癌裸鼠移植瘤模型。當(dāng)移植瘤平均直徑約4mm時造模成功，剔除造模未成功的1只裸鼠，將剩余裸鼠隨機分為4組:對照組、艾瑞昔布組、洛鉑組、艾

7、瑞昔布聯(lián)合洛鉑組，艾瑞昔布組8只，其余組7只。對照組口服等量滅菌蒸餾水及尾靜脈注射等量生理鹽水，艾瑞昔布組經(jīng)口灌胃艾瑞昔布片40mg·kg-1·d-1同時尾靜脈注射等量生理鹽水，洛鉑組經(jīng)尾靜脈注射洛鉑7.5mg·kg-1·w-1同時口服等量滅菌蒸餾水，艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組給藥方法和劑量與單一用藥組相同。給藥6周后，采用頸椎脫臼法處死裸鼠并完整剝?nèi)∧[瘤組織。使用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑(a)、短徑(b)，按公式V=ab2/2，估算移植瘤近似

8、體積并稱重量。用4％多聚甲醛固定腫瘤組織，免疫組織化學(xué)和流式細胞術(shù)分別檢測各組移植瘤組織E-cadherin、Ezrin、PTEN及Cortactin蛋白表達，Real-Time PCR檢測各組移植瘤組織E-cadherin、Ezrin、PTEN及Cortactin mRNA含量。
　　結(jié)果:
　　1、接種30只裸鼠，29只成瘤，成瘤時間集中在7～12天。艾瑞昔布組1只裸鼠死于灌胃。與對照組相比，艾瑞昔布組、洛鉑組及艾瑞昔布

9、聯(lián)合洛鉑組腫瘤體積減?。≒＜0.05），重量減輕(P＜0.05)，壞死區(qū)域增多;與單藥組相比，艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組腫瘤體積減小(P＜0.05)，重量減輕(P＜0.05)，壞死區(qū)域增多。
　　2、免疫組織化學(xué)及流式細胞術(shù)檢測移植瘤組織E-cadherin、Ezrin、PTEN及Cortactin蛋白表達結(jié)果表明，艾瑞昔布組及艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組E-cadherin、PTEN蛋白表達較對照組升高(P＜0.05)，Ezrin、Cortact

10、in蛋白表達較對照組降低(P＜0.05);艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組E-cadherin、PTEN蛋白表達較單藥組升高(P＜0.05)，Ezrin、Cortactin蛋白表達較單藥組降低（P＜0.05）;艾瑞昔布組與洛鉑組E-cadherin、Ezrin、PTEN及Cortactin蛋白表達無明顯差別（P＞0.05）。
　　3、Real-Time PCR檢測移植瘤組織E-cadherin、 Ezrin、PTEN及Cortactin mRN

11、A含量結(jié)果表明，艾瑞昔布組及艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組E-cadherin、PTEN mRNA含量較對照組升高(P＜0.05)，Ezrin、CortactinmRNA含量較對照組降低(P＜0.05);艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑組E-cadherin、PTEN mRNA含量較單藥組升高(P＜0.05)，Ezrin、Cortactin mRNA含量較單藥組降低（P＜0.05）;艾瑞昔布組與洛鉑組E-cadherin、Ezrin、PTEN及Cortactin

12、mRNA含量無明顯差別（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、艾瑞昔布單藥及聯(lián)合洛鉑均能抑制非小細胞肺癌的生長。
　　2、艾瑞昔布單藥及聯(lián)合洛鉑可上調(diào)E-cadherin蛋白及E-cadherinmRNA、PTEN蛋白及PTEN mRNA的表達，下調(diào)Ezrin蛋白及EzrinmRNA、Cortactin蛋白及Cortactin mRNA的表達，抑制非小細胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移;艾瑞昔布聯(lián)合洛鉑可提高艾瑞昔布或洛鉑單藥抑制非小