香菇多糖抑制MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用及機(jī)制研究.pdf

1、香菇多糖是從香菇子實(shí)體中提取的一種藥用多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染和抗病毒等活性，且毒副作用小。香菇多糖于1985年在日本批準(zhǔn)上市為抗癌新藥，在臨床上輔助治療腫瘤。但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、抗腫瘤機(jī)制不明確，限制了香菇多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和臨床使用。
　　目前對(duì)香菇多糖的抗癌免疫活性機(jī)制研究較多。多數(shù)研究者認(rèn)為香菇多糖無(wú)直接的細(xì)胞毒作用,主要通過(guò)免疫途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，例如增強(qiáng)誘導(dǎo)殺傷T細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗體依賴性巨噬細(xì)胞活性等。
　　

2、然而，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖除了能提高宿主免疫功能間接抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞外，還能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化或凋亡、影響癌基因表達(dá)等途徑發(fā)揮直接抗腫瘤作用。因此，深入研究香菇多糖抗腫瘤活性，闡明其直接抗腫瘤作用和機(jī)制變得十分重要。
　　本論文采用水提醇沉、H2O2脫色和超濾技術(shù)得到香菇多糖，并檢測(cè)其分子量和糖含量。體外實(shí)驗(yàn)研究香菇多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖抑制作用和誘導(dǎo)凋亡作用，并探討其分子作用機(jī)制。建立MCF-7裸鼠移植瘤模型

3、，研究香菇多糖的治療作用，并初步探索分子機(jī)制。為闡明香菇多糖直接抗腫瘤作用機(jī)制作出貢獻(xiàn)，也為增加香菇多糖臨床使用范圍提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　第一部分、香菇多糖制備
　　以湖北房縣香菇子實(shí)體為原料，采用水提醇沉方法提取香菇粗多糖，并經(jīng)H2O2脫色、超濾、冷凍干燥得香菇多糖。苯酚-硫酸法檢測(cè)其糖含量約為98％；高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量為6.23×105Da，且分子量均一；紫外掃描顯示香菇多糖幾乎不含核

4、酸和蛋白質(zhì)。以上結(jié)果顯示，本方法制備的香菇多糖性狀良好，純度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　第二部分、香菇多糖體外對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用及機(jī)制研究
　　采用MTT比色法考察香菇多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7增殖抑制作用。結(jié)果表明，香菇多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，且呈劑量依賴性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低（250μg/mL）、中（500μg/mL）、高（1000μg/mL）劑量組誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡呈明顯的劑量依賴性

5、，各劑量組細(xì)胞凋亡率分別為（4.69±1.43）%、（6.90±0.92）%、（9.97±0.75）%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香菇多糖對(duì)腫瘤的抑制作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。
　　為探究香菇多糖誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-7的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，Ba

6、x表達(dá)水平隨著多糖濃度增加而升高；Bcl-2表達(dá)水平隨著多糖濃度增加而降低。香菇多糖各劑量組Bax/Bcl-2值皆比陰性組大，且中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞中Cytochrome c的表達(dá)量隨著香菇多糖濃度升高而增加。Cleaved Caspase-7表達(dá)水平結(jié)果顯示，中、高劑量組香菇多糖能促進(jìn)Caspase-7活化，而低劑量組香菇多糖對(duì)Caspase-7影響小。綜上，香菇多糖作用于MCF-7細(xì)胞后，通過(guò)上調(diào)Bax表達(dá)水平，下調(diào)B

7、cl-2表達(dá)水平，引起線粒體膜通透性改變，Cytochrome c從線粒體內(nèi)釋放到胞漿。最終引起Caspase-7活化，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　第三部分香菇多糖體內(nèi)抑制MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用及機(jī)制研究
　　建立人乳腺癌MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，考察香菇多糖對(duì)MCF-7裸鼠移植模型腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其分子機(jī)制。裸鼠皮下注射MCF-7細(xì)胞，建立荷瘤裸鼠模型，并隨機(jī)分為4組，陰性對(duì)照組（尾靜脈注射等體積生理鹽水，q

8、d×21），香菇多糖低、中、高劑量組（分別尾靜脈注射香菇多糖5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg，qd×21）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察裸鼠狀態(tài)，記錄體重、腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量脾臟和腫瘤重量，計(jì)算抑瘤率，以此評(píng)價(jià)香菇多糖的抗腫瘤效果。對(duì) MCF-7腫瘤組織進(jìn)行 HE染色、TUNEL染色，觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香菇多糖低、中、高劑量對(duì)MCF-7實(shí)體瘤的抑制率分別為26%，39%和46%，呈劑量依賴性。香菇多糖組脾臟重量與

9、對(duì)照組相比差異小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于裸鼠免疫功能缺失，香菇多糖免疫調(diào)節(jié)活性受限。由以上結(jié)果可推測(cè)香菇多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮直接抗腫瘤作用。
　　為探究香菇多糖誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blot）檢測(cè)MCF-7腫瘤組織中細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-7的表達(dá)。結(jié)果顯示，與陰性組相比，香菇多糖劑量依賴性降低抗凋亡蛋

10、白Bcl-2表達(dá)量；升高促凋亡蛋白Bax表達(dá)量。且中、高劑量能顯著增加Bax/Bcl-2值，低劑量組Bax/Bcl-2值增加不明顯。低、中、高劑量組Cytochrome c的表達(dá)量分別增加了9%，35%和145%，且都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。低、中、高劑量組cleaved Caspase-7的表達(dá)量分別增加了23%，88%和105%。但由于個(gè)體差異大，與陰性組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜上，荷瘤小鼠尾靜脈注射香菇多糖后，會(huì)觸發(fā)腫瘤組織中線粒體參與的細(xì)胞