egfp在集胞藻6803中克隆及其表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、自1968年藍(lán)藻被證實(shí)具有遺傳重組現(xiàn)象開始，越來(lái)越多的人致力于藍(lán)藻基因工程研究。隨著藍(lán)藻基因工程的發(fā)展，有一批外源基因被導(dǎo)入到藍(lán)藻中表達(dá)。主要涉及環(huán)境治理、代謝調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)保健品和基因工程藥物表達(dá)等應(yīng)用領(lǐng)域。但是，外源基因表達(dá)效率低下的瓶頸制約了藍(lán)藻基因工程的發(fā)展，無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。 影響基因表達(dá)的因素有很多。如：基因拷貝數(shù)、密碼子偏好性、啟動(dòng)子、終止子、反義RNA技術(shù)以及蛋白表達(dá)策略等。本研究試圖從選擇啟動(dòng)子、改變SD序列

2、入手，對(duì)改進(jìn)藍(lán)藻外源基因表達(dá)系統(tǒng)和提高外源基因表達(dá)效率做一些探討。 集胞藻6803(Synechocystis sp.strain PCC6803)是一種單細(xì)胞藍(lán)藻，具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、不產(chǎn)生毒素、細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、方便分子操作等的特點(diǎn)，在特殊培養(yǎng)條件下還可以進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，非常適合于利用光合生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)。因此，集胞藻6803是種很好的藍(lán)藻基因工程受體。 本研究選擇集胞藻6803染色體DNA中c

3、upA基因及其下游相連的兩個(gè)片段分別作為上游整合平臺(tái)(up)和下游整合平臺(tái)(down)，在二者間插入誘導(dǎo)型高效啟動(dòng)子、egfp(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因)報(bào)告基因、卡那霉素抗性篩選標(biāo)記，構(gòu)建得到集胞藻6803同源重組雙交換整合平臺(tái)。 在整合平臺(tái)的基礎(chǔ)上，通過更換啟動(dòng)子和進(jìn)行SD序列距離修飾，共得到6個(gè)帶啟動(dòng)子和1個(gè)不帶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化載體。把轉(zhuǎn)化載體分別自然轉(zhuǎn)化到野生型集胞藻6803中，經(jīng)卡那霉素篩選得到7個(gè)轉(zhuǎn)基因藻。它們分別含有能夠

4、被紅光誘導(dǎo)的Popeβ(轉(zhuǎn)pK-Pcpcβ集胞藻6803和轉(zhuǎn)pK-Pcpcβ2集胞藻6803)、被溫度誘導(dǎo)的PgroESL(轉(zhuǎn)pK-PgroESL，集胞藻6803和轉(zhuǎn)pK.PgroESL2集胞藻6803)、被光照誘導(dǎo)的PpsbA(轉(zhuǎn)pK-PpsbA集胞藻6803和轉(zhuǎn)pK-PpsbA2集胞藻6803)和1個(gè)不帶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)pK-P0集胞藻6803。 根據(jù)啟動(dòng)子的不同誘導(dǎo)特性，分別設(shè)計(jì)梯度誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)EGFP表達(dá)，通過檢測(cè)EGFP(增