轉(zhuǎn)Δ5去飽和酶基因的集胞藻PCC6803研究.pdf

1、多不飽和脂肪酸具有極其重要的營養(yǎng)價值和藥用價值，其原料主要來自海洋魚類。隨著環(huán)境的惡化，海洋魚類資源日趨枯竭，并且魚油來源的多不飽和脂肪酸在提純過程中會殘留魚腥味，提取工藝繁瑣，開發(fā)新的多不飽和脂肪酸資源成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。微藻是多不飽和脂肪酸的初級生產(chǎn)者，但常溫下含量極低，通過分子生物學(xué)的方法改造微藻，有望提高多不飽和脂肪酸含量。
　　 集胞藻PCC6803是一種單細(xì)胞嗜中溫藍(lán)藻，在BG-11培養(yǎng)基中最適生長溫度為30℃，在2

2、5℃-40℃溫度區(qū)間較適其生長。在其基因組中具有參與多不飽和脂肪酸合成的△6(desA，sll0262)，△9(desC，sll0541)，△12(desD，slr1350)和ω-3(desB，sll1441)去飽和酶基因以及延長酶基因(sll2024)。其中△6(desA，sll0262)，△12(desD，slr1350)和ω-3(desB，sll1441)的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)，ω-3(sll1441)的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)最為顯著，因此在3

3、0℃下多不飽和脂肪酸含量極低。枯草芽孢桿菌具有△5去飽和酶基因des，也具有受冷誘導(dǎo)的特征，本文將來源于枯草芽孢桿菌的△5DS基因?qū)隤CC6803中，以期構(gòu)建產(chǎn)多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因集胞藻。本研究內(nèi)容共分4個部分：
　　 第一將來源于集胞藻的強(qiáng)啟動子PglnA與來源于枯草芽孢桿菌的△5脂肪酸去飽和酶基因的全編碼序列進(jìn)行重組，并將重組基因置于整合平臺質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化集胞藻PCC6803后，通過與染色體上的同源序列雙交換，使重組基因整

4、合于PCC6803細(xì)胞的染色體上，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因集胞藻DR157；
　　 第二將強(qiáng)啟動子PglnA與desB中包括起始密碼子的一段序列進(jìn)行重組，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化PCC6803，以同源單交換的方式以強(qiáng)啟動子PglnA代替受低溫誘導(dǎo)最明顯的desB基因的啟動子，構(gòu)建了單交換子SR169和轉(zhuǎn)基因集胞藻SR169DR157；
　　 第三分析轉(zhuǎn)基因集胞藻的有關(guān)生理特征，如不同培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)基因集胞藻的生長速度、細(xì)胞色素等，優(yōu)化培養(yǎng)條件以提

5、高集胞藻的培養(yǎng)密度；
　　 第四分析轉(zhuǎn)基因集胞藻多不飽和脂肪酸的組成和含量。在30℃混養(yǎng)條件下，DR157、SR169DR157與對照樣品DR1188不飽和脂肪酸成分沒有變化，但不飽和脂肪酸含量有所變化；在20℃混養(yǎng)條件下，DR157、SR169DR157與對照樣品DR1188不飽和脂肪酸成分及相對含量均有變化。
　　 本研究得到以下主要結(jié)論：
　　 第一△5去飽和酶基因在集胞藻PCC6803細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物能促