蕨類植物抱石蓮的化學(xué)成分及抗氧化活性研究.pdf

1、目的:
　　蕨類植物(Pteridophyte)，又名羊齒植物，是植物發(fā)展史上一個(gè)特殊的分支，它們?cè)诜N質(zhì)和代謝方面表現(xiàn)出多樣性。在植物分類系統(tǒng)中，蕨類植物是介于苔蘚植物和種子植物之間的一個(gè)類群，既是維管束植物又是孢子植物。蕨類植物在世界各地分布廣泛，目前全世界約有蕨類植物1.2萬(wàn)種，我國(guó)約有2600多種，約占世界總數(shù)的1/5，是世界上蕨類植物種類較多的地區(qū)之一，其中有396余種可供藥用。蕨類植物應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，特別是在醫(yī)藥保健、食品

2、、觀賞、綠化、工業(yè)等方面，其經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值受到人們的廣泛關(guān)注。藥用蕨類植物富含多種天然活性成分，其所具有的生物活性如抗菌、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等作用近年受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，具有極大的開(kāi)發(fā)前景。文獻(xiàn)研究表明，目前仍有一些種類的活性成分尚未被充分認(rèn)識(shí)，且臨床應(yīng)用較少，為了更好地開(kāi)發(fā)利用藥用蕨類植物資源，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分及生物活性的研究具有十分重要的意義。
　　抱石蓮(Lepidogrammitis drymoglossoides(B

3、ak.) Ching)為水龍骨科(Polypodiaceae)骨牌蕨屬（Lepidogrammitis）的蕨類植物，廣泛分布于長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)。它為貴州苗族、侗族民間常用藥物，常用于治療毒蛇咬傷、跌打損傷、內(nèi)外傷出血、疔瘡皰疹等病癥。以抱石蓮為主藥之一制成的制劑“復(fù)方蛇鱗草”及“復(fù)方蛇鱗草膏”，在臨床中治療毒蛇咬傷、甲溝炎等均取得了確切療效。但目前關(guān)于抱石蓮活性成分研究的報(bào)道較少，本課題組對(duì)抱石蓮的化學(xué)成分及其生物活性進(jìn)行了系統(tǒng)深入的

4、研究，為抱石蓮藥材的質(zhì)量控制及其藥用植物資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。
　　方法:
　　本文對(duì)抱石蓮的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并對(duì)其各提取部位及分離得到的單體化合物進(jìn)行了體外抗氧化活性的篩選;運(yùn)用HPLC法對(duì)分離得到的新化合物進(jìn)行了含量測(cè)定。
　　抱石蓮干燥全草21 Kg，以95％乙醇溶液加熱回流提取2次，每次2小時(shí)，合并2次提取液，減壓濃縮得浸膏(1.2 kg)。浸膏以適量蒸餾水分散，依次以等體積的石油醚、氯仿、乙

5、酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑分別得石油醚(239.5 g)、氯仿(132.0 g)、乙酸乙酯(56.0 g)、正丁醇(122.5 g)四個(gè)提取部位。采用硅膠、SephadexLH-20、大孔吸附樹(shù)脂等柱色譜及高效液相色譜技術(shù)對(duì)上述四個(gè)部位進(jìn)行分離純化，得到單體化合物。綜合運(yùn)用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)及核磁共振光譜(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY)等

6、波譜學(xué)技術(shù)，結(jié)合化合物的理化性質(zhì)對(duì)所得單體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
　　選用外源性自由基清除實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)抱石蓮的各提取部位及所得單體化合物進(jìn)行體外抗氧化活性的篩選。外源性自由基清除實(shí)驗(yàn)包括DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、ABTS·+自由基清除實(shí)驗(yàn)、羥基自由基(·OH)清除實(shí)驗(yàn);體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用永生系小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞，通過(guò)MTT法檢測(cè)對(duì)谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的抑制活性來(lái)評(píng)價(jià)抱石蓮部分單體化合物的抗氧化活性

7、。
　　采用高效液相色譜(HPLC)法，對(duì)新化合物（filic-3-ene-28 oic acid，化合物1）進(jìn)行含量測(cè)定。色譜條件如下:Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀系統(tǒng);DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈(B)-0.5％磷酸水(A)(87∶13);流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm。
　　成果:
　　從

8、抱石蓮全草的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇部位共分離得到31個(gè)化合物，鑒定了其中29個(gè)成分，包括1個(gè)新化合物(1):filic-3-ene-28 oic acid(ZLD-1)、β-蛻皮甾酮(ZLD-2)、豆甾醇（ZLD-3）、β-谷甾醇(ZLD-4)、β-胡蘿卜苷(ZLD-5)、里白醇（ZLD-6）、烏蘇酸(ZLD-7)、大黃素甲醚(ZLD-8)、大黃素(ZLD-9)、傘形花內(nèi)酯(ZLD-10)、濱蒿內(nèi)酯(ZLD-11)、秦皮乙素(Z

9、LD-12)、咖啡酸(ZLD-13)、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(ZLD-14)、綠原酸(ZLD-15)、原兒茶酸(ZLD-16)、原兒茶醛(ZLD-17)、4-羥基苯甲酸甲酯(ZLD-18)、沒(méi)食子酸(ZLD-19)、阿魏酸(ZLD-20)、(-)-丁香樹(shù)脂酚-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（ZLD-21）、lyoniresinol(ZLD-22)、松脂醇二葡萄糖苷（ZLD-23）、正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷（ZLD-24

10、）、二十四酸二十二酯(ZLD-25)、二十八烷酸二十六酯（ZLD-26）、正三十一烷酸乙酯(ZLD-27)、棕櫚酸(ZLD-28)、硬脂酸(ZLD-29)。
　　對(duì)抱石蓮的各提取部位和各單體化合物進(jìn)行的外源性自由基清除實(shí)驗(yàn)中結(jié)果顯示，抱石蓮的乙醇總提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和氯仿部位對(duì)DPPH、ABTS·+和·OH自由基表現(xiàn)出明顯的清除作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系;單體化合物中秦皮乙素(ZLD-12)、咖啡酸(ZLD-1

11、3)、咖啡酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(ZLD-14)、綠原酸(ZLD-15)、原兒茶酸(ZLD-16)、原兒茶醛(ZLD-17)、4-羥基苯甲酸甲酯(ZLD-18)、沒(méi)食子酸(ZLD-19)、阿魏酸(ZLD-20)這9個(gè)化合物對(duì)DPPH、ABTS·+、·OH三種自由基有明顯的清除效果，其中化合物綠原酸（ZLD-15）、原兒茶酸（ZLD-16）、原兒茶醛(ZLD-17)、沒(méi)食子酸(ZLD-19)的IC50值小于陽(yáng)性對(duì)照物Vc的。細(xì)胞

12、實(shí)驗(yàn)篩選部分化合物的抗氧化活性結(jié)果顯示化合物filic-3-ene-28 oicacid(ZLD-1)、豆甾醇（ZLD-3）、大黃素甲醚(ZLD-8)、咖啡酸(ZLD-13)、原兒茶醛（ZLD-17）在10μM濃度下有明顯抑制谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的活性。
　　采用HPLC法對(duì)抱石蓮中新化合物filic-3-ene-28 oic acid的含量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，filic-3-ene-28 oic acid在3

13、7.5～290μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率為99.96％(RSD=1.61％，n=6)，平均含量為0.086 mg·g-1。
　　結(jié)論:
　　從抱石蓮全草的95％乙醇提取物中共分離得到31個(gè)化合物，并通過(guò)理化性質(zhì)結(jié)合波譜數(shù)據(jù)分析鑒定了其中29個(gè)化合物。它們分屬于不同的結(jié)構(gòu)類型，包括3個(gè)三萜、3個(gè)香豆素、2個(gè)蒽醌、4個(gè)甾體及苷、3個(gè)木脂素及苷和14個(gè)酚酸及脂肪酸類化合物，其中化合物1為新化合物，另

14、有17個(gè)化合物(3、7、9～11、14～15、18～22、24～27、29)為首次從抱石蓮中分離得到。研究結(jié)果表明抱石蓮中主要化學(xué)成分類型為酚酸及甾體類化合物。
　　對(duì)抱石蓮的各提取部位和各單體化合物進(jìn)行體外抗氧化活性的篩選，結(jié)果表明，其抗氧化活性部位主要為乙酸乙酯和正丁醇部位，主要抗氧化作用的成分為酚酸類化合物，此外三萜及甾體類也表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。
　　本文建立了抱石蓮中filic-3-ene-28 oic acid