血漿miRNA與腰椎間盤退變的相關(guān)性及補腎壯督方的干預(yù)研究.pdf

1、目的:
　　1.篩選腰椎間盤退變(Lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD)患者血漿中差異性表達(dá)的miRNA，探討差異性血漿miRNA是否在LIDD人群中具有特異性表達(dá)，是否對LIDD診斷有價值。
　　2.建立大鼠LIDD的動物模型，進一步驗證差異性miRNA的表達(dá)與LIDD的關(guān)系，并檢測椎間盤中差異性miRNA靶基因介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)變化。
　　3.通過補腎壯督方

2、干預(yù)LIDD大鼠，探討補腎壯督方對差異性miRNA及其靶基因介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)影響，進一步揭示補腎壯督方延緩LIDD的作用機制。
　　方法:
　　1.臨床研究
　?、龠x取2015年12月-2016年4月就診于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱科住院部及門診的3例LIDD患者作為病例組，同期選取3例年齡和性別相匹配且無LIDD的志愿者作為對照組。抽取LIDD患者和無LIDD志愿者的血漿，進行MicroRNA芯片的篩選。

3、
　?、谕ㄟ^實時熒光定量RT-PCR對MicroRNA芯片篩選出差異表達(dá)明顯的miRNA進行原位驗證，選出與LIDD密切相關(guān)的差異表達(dá)miRNA。
　　③收集2015年12月-2016年8月就診于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱科住院部及門診的30例LIDD患者作為病例組，同期選取20例年齡和性別相匹配且無LIDD的志愿者作為對照組。根據(jù)原位驗證的結(jié)果，以及文獻報道研究，將與LIDD密切相關(guān)的miRNA在這50例人群中進行擴大

4、樣本驗證研究，進一步驗證差異miRNA表達(dá)與LIDD的特異性。并對有差異性的miRNA進行受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析，使用ROC曲線下面積(AUC)評估它們的診斷價值。
　　2.實驗研究
　　選取60只雄性SD大鼠（3月齡），隨機分為假手術(shù)組、模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組，每組各12只。假手術(shù)組:從大鼠的腹部右側(cè)旁正中切開，暴露L4到L6椎間盤后即縫合皮膚。其他組:從大鼠的腹部右側(cè)旁正中切開后，

5、暴露L4到L6椎間盤，并采用纖維環(huán)的全層穿刺法建立大鼠LIDD模型。造模第2天，低劑量中藥組、中劑量中藥組和高劑量中藥組分別給予低劑量、中劑量和高劑量的補腎壯督方水煎液灌胃，假手術(shù)組和模型組則分別予等容積的生理鹽水灌胃。8周后，取大鼠的血漿和L4到L6的椎間盤。用HE染色觀察各組椎間盤的退變情況，并根據(jù)其退變程度進行病理評分，通過實時熒光定量RT-PCR檢測血漿和腰椎間盤中的特異性miRNA的表達(dá)，采用蛋白質(zhì)印跡法和實時熒光定量RT-P

6、CR分析腰椎間盤中特異性miRNA靶基因及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.臨床研究
　?、賛iRNA芯片篩選出LIDD人群中存在23個差異表達(dá)的miRNA，其中7個miRNA表達(dá)下調(diào)，16個miRNA表達(dá)上調(diào)。
　?、诟鶕?jù)MicroRNA芯片結(jié)果，對17個差異表達(dá)穩(wěn)定的miRNA進行了原位驗證，只有miRNA-4763-3p和miRNA-4767的下調(diào)表達(dá)差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05

7、）。
　　③結(jié)合文獻報道研究，將miRNA-4763-3p、miRNA-4767和miRNA-125a-5p進行了擴大樣本驗證研究。miRNA-4767和miRNA-125a-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），miRNA-4763-3p的表達(dá)下調(diào)則不明顯，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　④ROC曲線分析顯示，miRNA-4767和miRNA-125a-5p是對LIDD診斷有價值的生物標(biāo)記物（P＜0.05

8、）。其中miRNA-4767 AUC值為0.735，95％置信區(qū)間CI為:0.591-0.850;miRNA-125a-5p的AUC值為0.863，95％置信區(qū)間CI為:0.759-0.967。
　　2.實驗研究
　?、俑鹘M腰椎間盤HE染色的形態(tài)學(xué)改變
　　與假手術(shù)組比較，模型組的腰椎間盤發(fā)生了明顯的退變，組織退變評分顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組相比，低劑量、中劑量、高劑量中藥組的腰椎間盤退變均出

9、現(xiàn)了明顯改善，組織學(xué)退變的評分均顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);補腎壯督方三個中藥組之間的組織學(xué)退變評分比較亦有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　?、诟鹘M血漿中miRNA-125a-5p的表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組血漿中miRNA-125a-5p的表達(dá)降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);與模型組相比，低、中、高劑量中藥組血漿中miRNA-125a-5p的表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;補腎壯督

10、方的三個中藥組血漿中miRNA-125a-5p之間的表達(dá)比較亦有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　③各組腰椎間盤組織中miRNA-125a-5p的表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組椎間盤組織中的miRNA-125a-5p表達(dá)明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;與模型組相比，低、中、高劑量中藥組椎間盤組織中的miRNA-125a-5p表達(dá)則明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;補腎壯督方的三個中藥組椎間盤組織中的mi

11、RNA-125a-5p表達(dá)之間比較亦有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　?、芨鹘MmiRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的基因表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組的TP53INP1、p21和caspase-3基因表達(dá)都明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;與模型組相比，低、中、高劑量中藥組的TP53INP1、p21和caspase-3基因表達(dá)都明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;補腎

12、壯督方的三個中藥組之間比較亦有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　⑤各組miRNA-125a-5p靶基因TP53INP1及p21、活化的Caspase-3的蛋白表達(dá)變化
　　與假手術(shù)組比較，模型組的TP53INP1、p21和活化的Caspase-3(Active Caspase-3)蛋白表達(dá)都明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）;與模型組相比，低、中、高劑量中藥組的TP53INP1、p21和caspase-3的基因表達(dá)都明

13、顯減低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);補腎壯督方的三個中藥組之間比較亦有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.腰椎間盤退變患者外周循環(huán)血漿中存在差異表達(dá)的miRNA，血漿miRNA-4767和miRNA-125a-5p在LIDD患者中的表達(dá)顯著降低。
　　2.血漿miRNA-4767和miRNA-125a-5p對LIDD的診斷具有較好的診斷效能，有望成為腰椎間盤退變精準(zhǔn)診斷的新型生物標(biāo)志物。
　　3.

14、補腎壯督方能夠有效的延緩大鼠腰椎間盤退變的病理改變，降低椎間盤退變的病理評分，并且療效具有一定的劑量依賴性。
　　4.miRNA-125a-5p在腰椎間盤退變的大鼠血漿及退變的椎間盤組織中表達(dá)明顯降低，而在其靶基因TP53INP1及p21、Caspase-3的表達(dá)則明顯升高。這表明在LIDD的過程中miRNA-125a-5p及其靶基因TP53INP1介導(dǎo)的通路被激活，miRNA-125a-5p是腰椎間盤退變的一個潛在治療靶點。