人參皂甙Rg1強(qiáng)化嗅鞘細(xì)胞生物學(xué)行為的實驗研究.pdf

1、目的：⑴建立一種經(jīng)濟(jì)實用、易重復(fù)、細(xì)胞培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量大的嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)、純化方法。⑵研究人參皂甙Rg1對嗅鞘細(xì)胞(OECs)增殖及相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)表達(dá)、分泌等生物學(xué)行為的影響,尋找OECs有臨床應(yīng)用前景的調(diào)節(jié)因子。為OECs移植修復(fù)脊髓損傷更好解決種子細(xì)胞的來源和生物學(xué)活力問題。
　　 方法：①剪切吹打分散法接種嗅鞘細(xì)胞及三步順序法純化培養(yǎng):從成年SD大鼠解剖分離嗅球,顯微鏡下剝離軟腦膜、剔除中央白質(zhì),將灰質(zhì)成分置于

2、含10％胎牛血清的DMEM/F12全培養(yǎng)基,眼科剪剪切至組織成糜狀,吸管吹打15-20次,混懸液免胰酶消化直接接種培養(yǎng),每三天半量換液。原代培養(yǎng)至細(xì)胞大部分融合后,依次以低濃度胰酶(0.05％)有限消化法、30min短時差速貼壁法、抗有絲分裂法三步順序純化細(xì)胞,每步純化結(jié)果作共聚焦免疫熒光染色鑒定。②研究Rg1對嗅鞘細(xì)胞增殖的影響MTT法:OECs鑒定純化后分組,Rg1以濃度梯度0(空白對照)、10、20、40、80μg/ml分別干預(yù)細(xì)

3、胞24 h、48 h、72 h、96 h,MTT染色OD值繪制生長趨勢圖,得出Rg1對OECs作用的最適濃度和最適作用時間的結(jié)論,并作為以下所有實驗步驟的基礎(chǔ),以此策略干預(yù)細(xì)胞；Brdu測24 h細(xì)胞增殖率:細(xì)胞分三組,空白對照組,Rg1組,Forskolin陽性參照組,BrdU免疫熒光染色法測細(xì)胞增殖率。③研究Rg1對OECs相關(guān)NTFs表達(dá)和分泌的影響RT-PCR:細(xì)胞純化鑒定后分兩組,一組對照,一組Rg1的最適濃度和時間干預(yù),通過

4、RT-PCR電泳條帶對比亮度法分析Rg1對OECs膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神經(jīng)生長因子(nervegrowth factor,NGF)mRNA表達(dá)的影響； ELISA試劑盒:分別測上述兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)GDNF、BDNF、NGF的含量,并作統(tǒng)計學(xué)分析。

5、
　　 結(jié)果：⑴細(xì)胞取材接種過程較傳統(tǒng)方法大大簡化,由60-90 min多步驟過程簡化為8-10 min一步完成,原代培養(yǎng)中嗅鞘細(xì)胞快速貼壁成為優(yōu)勢細(xì)胞、生長旺盛,三步順序純化過程細(xì)胞純度逐步提高,以最小代價、最少細(xì)胞損耗獲得純度提升,最終鑒定純度可達(dá)95％以上并長時間維持。⑵Rg1促進(jìn)嗅鞘細(xì)胞增殖,獲得峰值效應(yīng)；24 h增殖率:空白對照組9％,Rg1組17％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Forskolin組20％,同Rg

6、1組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。⑶RT-RCR分析顯示Rg1干預(yù)組細(xì)胞GDNF、BDNF、NGF的mRNA較對照組表達(dá)顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ELISA法測Rg1組培養(yǎng)上清GDNF、BDNF、NGF分泌量較對照組顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：①免消化剪切吹打分散法接種OECs及其三步順序法純化培養(yǎng)方法經(jīng)濟(jì)實用、易重復(fù),細(xì)胞培養(yǎng)周期短,革新了傳統(tǒng)培養(yǎng)純化方法,能收獲大量可控純度