人參皂甙Rg3對(duì)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤,而且呈現(xiàn)不斷攀升的趨勢(shì),其5年生存率僅有15％左右。近年來,隨著診療方法的進(jìn)步,合理地綜合應(yīng)用現(xiàn)有的手術(shù)、放療和化療等幾種治療手段,肺癌的某些亞型治愈率已經(jīng)有所提高,但總體療效仍不理想。日益增加的肺癌患者人數(shù)和較低的治愈率已經(jīng)成為當(dāng)前困擾全世界醫(yī)務(wù)工作者的難題。根據(jù)肺癌的組織學(xué)表現(xiàn)將其分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等亞型,其中肺鱗癌約占所有原發(fā)性肺癌的35％～45％。

2、　　 惡性腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,包括癌基因的活化、瘤細(xì)胞凋亡與增殖失衡、瘤組織新生血管形成、瘤細(xì)胞脫落并侵入基質(zhì)等步驟。在這一系列的過程中,各個(gè)步驟相互作用又相對(duì)獨(dú)立,只要某一個(gè)步驟未獨(dú)立完成,腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲就不能得以實(shí)現(xiàn)。
　　 人參是一種五加科多年生草本植物,作為一種中藥,在我國(guó)有幾千年的應(yīng)用歷史。人參具有廣泛的藥用價(jià)值,其主要活性成分人參皂甙具有抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化等作用。目前從人參中分離提純

3、獨(dú)立的人參皂甙成分并揭示其作用機(jī)制已經(jīng)成為各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。人參皂甙Rg3是人參皂甙的一種,已有研究表明Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性等多種抗腫瘤活性。因此,人參皂甙Rg3作為一種重要的腫瘤輔助治療藥物,具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。有關(guān)Rg3對(duì)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲影響的研究,除本課題組前期發(fā)表的相關(guān)文章外,迄今國(guó)內(nèi)外未見其他文獻(xiàn)報(bào)道

4、。
　　 為深入探討人參皂甙Rg3對(duì)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響,尋求除手術(shù)、放療和化療以外肺鱗癌有效的治療方法,本研究首先采用MTT比色法、流式細(xì)胞儀、免疫細(xì)胞化學(xué)、原位雜交、RT-PCR、Western-blot等技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)了人參皂甙Rg3在體外對(duì)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞增殖、凋亡的影響及對(duì)凋亡相關(guān)基因survivin、livin mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響,探討了Rg3誘導(dǎo)SK-MES-1細(xì)胞凋

5、亡的分子機(jī)制；進(jìn)一步運(yùn)用Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、Western-blot、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、明膠酶譜法等技術(shù)檢測(cè)了Rg3在體外對(duì)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞侵襲及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制；最后在此基礎(chǔ)上建立裸鼠移植瘤模型,采用TUNEL、原位雜交、免疫組化等技術(shù)檢測(cè)了Rg3在動(dòng)物模型體內(nèi)對(duì)瘤細(xì)胞凋亡、增殖及survivin、livin表達(dá)的影響,并檢測(cè)了Rg3在體內(nèi)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶及其調(diào)控分子CXCL12、C

6、XCR4的影響,進(jìn)一步闡明了Rg3誘導(dǎo)SK-MES-1細(xì)胞凋亡、抑制其侵襲的機(jī)制與下調(diào)survivin、livin及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)密切相關(guān)。為探討人參皂甙Rg3對(duì)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制,為人參皂甙Rg3的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ),本研究分以下3個(gè)部分進(jìn)行了系列研究。
　　 第一部分人參皂甙Rg3對(duì)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　 方法：
　　 1.采用MTT法

7、測(cè)定經(jīng)5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Rg3分別作用24h、48h、72h后SK-MES-1細(xì)胞增殖活性的改變,并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 2.采用流式細(xì)胞儀測(cè)定人參皂甙Rg3對(duì)SK-MES-1細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3.采用RT-PCR和原位雜交技術(shù)檢測(cè)人參皂甙Rg3對(duì)SK-MES-1細(xì)胞survivin、livin mRNA表達(dá)的影響。
　　 4.采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Weste

8、rn-blot技術(shù)檢測(cè)人參皂甙Rg3對(duì)SK-MES-1細(xì)胞survivin、livin蛋白表達(dá)的影響。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理,采用單因素方差分析和LSD多重比較法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.Rg3作用后細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制,不同濃度組間(P<0.05)、不同時(shí)間組間(P<0.05)均存在顯著性差異。Rg3作用48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)最高水平。Rg3作用后

9、細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,且隨藥物濃度增加而更為顯著。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)顯示,隨著Rg3濃度增加,細(xì)胞凋亡率逐漸增加,各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.RT-PCR和原位雜交聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果顯示,Rg3作用后,survivin和livinmRNA表達(dá)均受到抑制,隨Rg3濃度增加,survivin和livin表達(dá)均逐漸降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.免疫細(xì)胞化學(xué)和We

10、stern-blot技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果顯示,Rg3作用后,survivin和livin蛋白表達(dá)均受到抑制,且具有一定的劑量依賴性,不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 第二部分人參皂甙Rg3對(duì)肺鱗癌SK-MES一1細(xì)胞侵襲力的影響及其機(jī)制
　　 方法：
　　 1.采用Boyden chamber侵襲實(shí)驗(yàn)計(jì)算不同濃度Rg3作用后穿膜的SK-MES-1細(xì)胞數(shù),以比較Rg3對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。
　

11、　 2.采用明膠酶譜法檢測(cè)Rg3對(duì)MMP-2,MMP-9活性的影響。
　　 3.采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)分別檢測(cè)Rg3對(duì)SK-MES-1細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　 4.采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中CXCL12、CXCR4水平。
　　 5.采用RT-PCR和Western-blot技術(shù)分別檢測(cè)Rg3對(duì)SK-MES-1細(xì)胞CXCL12、CXCR4 mRN

12、A和蛋白表達(dá)的影響。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理,采用單因素方差分析和LSD多重比較法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.Boyden chamber體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著Rg3濃度增加,穿越Matrigel膠的SK-MES-1細(xì)胞數(shù)逐漸減少,不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.明膠酶譜法顯示,隨著Rg3濃度增加,MMP-2和MMP-9酶活力

13、逐漸降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示,隨著Rg3濃度增加,MMP-2、MMP-9mRNA和蛋白表達(dá)逐漸降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.ELISA法檢測(cè)提示,經(jīng)Rg3作用后,SK-MES-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中的CXCL12、CXCR4含量顯著降低,不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5.Rg3

14、作用后,CXCL12和CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)降低,具有一定的劑量依賴性,不同濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 第三部分人參皂甙Rg3對(duì)肺鱗癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其機(jī)制
　　 方法：
　　 1.建立裸鼠SK-MES-1細(xì)胞移植瘤模型,通過灌胃給予不同劑量的Rg3,比較各組裸鼠成瘤大小。
　　 2.應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中SK-MES-1細(xì)胞凋亡情況。
　　 3

15、.采用原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中survivin、livin mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　 4.采用原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　 5.采用原位雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)各組裸鼠腫瘤組織中CXCL12、CXCR4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS17.0軟件處理,采用單因素

16、方差分析和LSD多重比較法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.隨著給予裸鼠的Rg3劑量增加,裸鼠移植瘤體積逐漸減小,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.TUNEL法顯示,隨著給予裸鼠的Rg3劑量增加,瘤組織內(nèi)SK-MES-1細(xì)胞凋亡率逐漸增加,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.給予Rg3后,裸鼠瘤組織內(nèi)survivin、livin mRNA和蛋白表達(dá)

17、均降低,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.隨著給予裸鼠的Rg3劑量增加,裸鼠瘤組織內(nèi)MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)均逐漸降低,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5.給予Rg3后,裸鼠瘤組織內(nèi)CXCL12、CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)均降低,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.人參皂甙Rg3能夠抑制肺鱗癌SK-MES-1

18、細(xì)胞增殖并能夠抑制SK-MES-1細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。
　　 2.人參皂甙Rg3在體外和動(dòng)物模型體內(nèi)具有誘導(dǎo)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞凋亡的作用,其作用機(jī)制可能與下調(diào)凋亡基因survivin、livin在mRNA和蛋白水平的表達(dá)有關(guān)。
　　 3.人參皂甙Rg3能夠降低SK-MES-1細(xì)胞的侵襲能力,其作用機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表達(dá),降低MMP-2、MMP-9的酶活力有關(guān)。